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柳蒿脂溶性成分对高脂血症大鼠脂代谢及相关基因和蛋白质表达的影响

徐艳华  
【摘要】:目的:通过柳蒿不同溶剂萃取物的化学成分及其降血脂活性筛选,摸清其整体化学信息和降血脂有效部位-脂溶性成分。经柳蒿脂溶性成分的对高脂血症大鼠脂代谢及相关基因和蛋白质表达的影响,阐明其降血脂作用机理。方法:柳蒿用95%乙醇回流提取,减压浓缩得到提取物,提取物再用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取得到不同溶剂萃取物。不同溶剂萃取物利用硅胶、Sephadex LH-20等柱色谱、TLC和HPLC等手段进行分离,再根据分离得到化合物的理化性质分析、波谱解析、对照品比较及与文献报道对比鉴定其结构。同时,采用尾静脉注射Triton wr-1339法建立大鼠高脂血症HLP(Hyperlipidemia,HLP)模型,对不同溶剂萃取物进行降血脂作用筛选,确定石油醚萃取物(柳蒿脂溶性成分)降血脂作用显著;利用气相色谱法测定柳蒿脂溶性成分中11个有效成分;然后,采用KM小鼠对柳蒿脂溶性成分进行急性毒性实验;采用SD大鼠高脂乳剂灌胃法(15m L/kg,1次/日,连续10d)建立HLP模型,模型大鼠分为模型组、阳性对照组(灌胃辛伐他汀片混悬液4mg/kg)、柳蒿低剂量组(柳蒿脂溶性成分90 mg/kg)、柳蒿高剂量组(柳蒿脂溶性成分180 mg/kg),每组各10只,另取10只作为空白对照,连续给药30d。采用全自动生化分析仪检测血脂四项指标、肝功五项、肾功二项指标;采用全自动酶标仪检测肝组织HL、LPL、HMG-Co AR含量;采用HE染色法观察肝组织内细胞脂肪变性程度;采用IHC法检测肝组织脂代谢相关蛋白AMPKα、SREBP-1、VCAM1的表达变化;采用Western blotting法检测大鼠肝组织脂代谢相关蛋白ABCA1、ACO2、PPARα的表达变化;采用q RT-PCR法检测大鼠肝组织脂代谢相关基因ABCA1、LXR、PPARα的表达。结果:1.柳蒿芽石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中分离得到24个化合物,分别为Chamazulene(1)、acetylenes(E)-2(2)、acetylenes(E)-3(3)、acetylenes(E)-4(4)、(+)-(S)-dihydro-ar-curcumene(5)、(+)-(S)-ar-curcumene(6)、(+)-(S)-dihydroar-turmerone(7)、(+)-(S)-ar-turmerone(8)、3,5,8a-Trimethyl-3a,6,7,8a,9a,9b-hexah ydro-3H,4H-naphtho[2,3b]furan-2,8-dione(9)、8-Isopropyl-4a-methyl-5-oxo-3,8-Isop ropyl-4a-methyl-5-oxo-3,4,4a,8-Isopropyl-4a-methyl-5-oxo-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydro-na phthalene-2-carbaldehyde(10)、4-Isopropyl-1-methyl-7-methylene-octahydro-naphthalene-1,4a-diol(11)、6-Hydroxy-3-isopropenyl-4a,5-dimethyl-2,3,4,4a,8,8a-hexahydronaphthalene-1,7-dione(12)、arteintegin A(13)、artefrigin(14)、eugenol(15)、palmitic acid(16)、oleic acid(17)、linoleic acid(18)、linolenic acid(19)、12,13-epoxy linolenic acid(20)、integracid(21)、caffeic acid(22)、sacriflavone A(23)、sacric acid A(24)。2.柳蒿不同溶剂萃取物降血脂活性筛选结果表明,柳蒿脂溶性成分降血脂作用显著。柳蒿脂溶性成分急性毒性实验结果表明,30 g/kg为最大给药剂量,未测到LD50。小鼠未见不良反应,对体重及肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏指数未产生影响,未见脏器畸形、肿瘤等不良改变。3.柳蒿脂溶性成分对高脂血症治疗作用及其机制研究表明,各建立模型组大鼠体重均较空白组显著升高(P0.05),在治疗后阳性对照组、柳蒿低、高剂量组体重较模型组显著降低(P0.05);同时大鼠一般状态优于模型组。从肝脏外观分析,模型组肝脏表面看略呈土黄色,表面粗糙而油腻,可见明显脂代谢异常。而阳性对照组、柳蒿低剂量组、柳蒿高剂量组肝脏颜色暗红、表面光滑油腻感不明显,柳蒿高剂量组接近空白组肝脏。HE染色表明,阳性对照组、柳蒿低、高剂量组肝细胞脂肪变性较模型组有明显的改善。生化分析仪检测结果表明,与空白组比较模型组血清TC、TG、LDL-C指标显著升高(P0.01、P0.05、P0.01),HDL-C指标显著降低(P0.05);血清ALT、AST、ALP、DBIL、TBIL指标显著升高(P0.05);血清BUN、Cr显著升高(P0.05)。与模型组比较阳性对照组TC、LDL-C指标均显著降低(P0.01);ALT、ALP、TBIL显著降低(P0.05);GLU指标较模型组显著降低(P0.05)。柳蒿低剂量组TC、LDL-C指标均显著降低(P0.01);HDL-C指标显著升高(P0.05);ALT、ALP较模型组显著降低(P0.05),ALP较阳性对照组显著降低(P0.05);GLU指标较模型组显著降低(P0.05)。柳蒿高剂量组TC、LDL-C指标均显著降低(P0.01);TG指标显著降低(P0.05);HDL-C指标显著升高(P0.05)。柳蒿高剂量组ALT、AST、ALP、TBIL较模型组显著降低(P0.05);AST、ALP较阳性对照组显著降低(P0.05)。BUN、Cr较模型组显著降低(P0.05)。与阳性对照组比较柳蒿低剂量组TG、ALP指标显著降低(P0.05);柳蒿高剂量组AST、ALP显著降低(P0.05)。ELISA实验结果表明,与空白组比较,模型组肝组织匀浆HL、LPL指标显著降低(P0.05),HMG-COA指标显著升高(p0.01)。与模型组比较,阳性对照组HL指标均升高,有显著差异(P0.05);HMGR显著降低(p0.01)。柳蒿低剂量组HL指标均升高,有显著差异(P0.05);LPL显著降低(P0.05);HMGR显著降低(p0.01)。柳蒿高剂量组肝组织匀浆HL指标均升高,有显著差异(P0.05);LPL显著降低(P0.05);HMGR显著降低(p0.01)。与阳性对照组比较柳蒿低剂量组HMGR显著降低(P0.05);柳蒿高剂量组LPL显著降低(P0.05)。IHC实验结果表明,模型组大鼠肝组织AMPKα蛋白表达较空白组显著下调(P0.05),SREBP1、VCAM1表达显著上调(P0.05);而阳性对照组和柳蒿高剂量组AMPKα蛋白表达较模型组显著上调(P0.05),SREBP1、VCAM1表达下调,均有显著差异(P0.05);柳蒿低剂量组对SREBP1表达较模型组显著下调(P0.05)。Western blotting实验表明,模型组ABCA1、PPARα蛋白表达较空白组显著下调(P0.05),ACO2蛋白表达较空白组显著上调(P0.05);阳性对照组与模型组比较ABCA1、PPARα蛋白表达显著上调(P0.05);柳蒿低剂量组、柳蒿高剂量组与模型组比较ABCA1、PPARα蛋白表达显著上调(P0.05),ACO2蛋白表达显著下调ACO2(P0.05);柳蒿高剂量组PPARα蛋白表达较阳性对照组显著上调(P0.05)。q RT-PCR实验结果表明,模型组ABCA1、LXR、PPARα基因表达较空白组显著下调(P0.05);阳性对照组LXR、PPARα基因表达较模型组显著上调(P0.01),柳蒿低剂量组、柳蒿高剂量组与模型组比较,ABCA1、LXR、PPARα基因均显著上调(P0.05),其中柳蒿高剂量组ABCA1基因表达较阳性对照组显著上调(P0.01)。结论:从柳蒿分离得到24个化合物中化合物13、14、23、24为未见文献报道的新化合物,1-4、15-20为首次从该植物中分离得到。按结构类型分类,编号1、5-13为萜类化合物,2-4为炔类化合物,16-20为脂肪酸类化合物,14、15、21、22、24为苯丙素类化合物和23为黄酮类化合物。建立了柳蒿芽脂溶性成分中11个有效成分的定量分析方法,为该部位的后期研究和开发利用奠定了可靠基础。柳蒿脂溶性成分具有明显的降血脂作用,其降血脂作用是通过调节ABCA1、ACO2、LXR、PPARα基因及AMPKα、SREBP1、VCAM1蛋白表达,达到调节血脂指标TC、TG、LDL-C、HDL-C的作用,维持体内脂质代谢平衡,避免肝脏脂质化。


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