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莲子心生物碱对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用研究

苟江敏  
【摘要】:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病。AD的病理特征主要包括胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)在脑内堆积引起的老年斑(SP),胞内Tau蛋白过度磷酸化造成的神经原纤维缠结(NFTs)及神经元缺失,并伴有明显的突触丢失等。本研究考察了莲子心生物碱(甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱)对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的保护及其抗阿尔茨海默病作用。本文的第一部分体外活性研究首先采用MTT法考察了甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱(0.1-10μM)及莲心总碱(0.06-6μg/mL)单独或与Aβ_(25-35)联合作用24 h后对PC12细胞存活率的影响。实验结果表明,莲子心生物碱可显著抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞存活率的降低,并且其单独作用不影响细胞存活率。采用HE染色法在倒置显微镜下观察PC12细胞形态变化,实验结果表明,Aβ_(25-35)损伤的细胞数量减少,细胞呈现不规则的梭形,固缩,间隙变大,部分细胞核固缩、染色加深。莲子心生物碱可抑制Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞形态的变化。进一步采用AO-EB和Annexin V-FITC/PI荧光染色法检测PC12细胞凋亡,实验结果表明,甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱(10μM)及莲心总碱(6μg/mL)均能够抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡。本文的第二部分体外机制研究首先采用荧光分光光度计,以Fura-2/AM为荧光探针,考察了莲子心生物碱对Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的影响,实验结果表明,Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞内[Ca~(2+)]_i浓度显著增高,给药24h后细胞内[Ca~(2+)]_i浓度显著降低。采用流式细胞仪,以Fluo-3/AM为荧光染料,进一步验证了莲子心生物碱可显著抑制Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞内[Ca~(2+)]_i浓度的增高。采用荧光分光光度计,以DCFH-DA为荧光探针,设置甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱的药物浓度为1、3、10μM,莲心总碱的药物浓度为0.6、2、6μg/mL,考察了药物对Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞内活性氧(ROS)水平的影响,结果表明,随着药物浓度的增加,细胞内ROS水平显著降低。采用Western blot分析法,考察了莲子心生物碱对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞中Tau蛋白磷酸化、总Tau蛋白及钙调蛋白(CaM)表达的影响,结果表明,莲子心生物碱与Aβ_(25-35)共同作用,可显著抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞内Tau磷酸化,降低细胞内CaM的表达。本文的第三部分体内实验主要考察了莲心总碱的抗阿尔茨海默病作用。将APP/PS1双转基因AD小鼠连续灌胃给予莲心总碱(50 mg/kg·d)28天,之后取脑组织进行石蜡切片并染色,提取海马和皮质总蛋白进行Western blot实验。实验分别设置三组,野生型小鼠组,APP/PS1模型组以及APP/PS1给药组。首先采用HE染色观察小鼠脑组织石蜡切片海马锥体细胞形态,结果表明,APP/PS1模型AD小鼠锥体细胞胞核深染、固缩,呈三角形或不规则形;APP/PS1给药组海马锥体细胞形态规则,排列整齐密集,胞核大而圆,呈均匀淡染。采用TUNEL染色法观察小鼠脑组织细胞凋亡的变化,实验结果表明,给药后小鼠脑内神经元细胞凋亡数目减少,表明药物可抑制小鼠神经元细胞凋亡。采用Western blot分析法检测小鼠海马和皮质组织中Tau蛋白磷酸化、总Tau蛋白及CaM的表达水平,实验结果表明,莲心总碱可显著抑制APP/PS1转基因AD小鼠海马和皮质组织中Tau蛋白的异常磷酸化,并且降低CaM的表达。综上所述,莲子心生物碱(甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱)可通过抑制Aβ_(25-35)损伤的PC12细胞内Ca~(2+)水平、CaM表达和ROS水平进而抑制细胞内Tau蛋白的过度磷酸化,从而减少细胞凋亡,对细胞产生保护作用。此外,莲心总碱可抑制APP/PS1转基因AD小鼠海马和皮质组织中CaM的表达,进而抑制Tau蛋白的磷酸化,并抑制神经元细胞凋亡。甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱及莲心总碱可能对阿尔茨海默病具有潜在的防治作用。


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