cglI基因复合体在构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株中的应用研究

【摘要】： 钝齿棒杆菌是氨基酸生产中的重要菌种,由于发酵生产过程的规模化和连续性,噬菌体污染一直是制约氨基酸发酵生产的重要因素之一,至今尚未得到有效解决。传统解决发酵工业中噬菌体污染问题的方法主要包括改善卫生条件和加强生产管理、添加噬菌体抑制剂和筛选抗性突变株。在细菌天然发生的噬菌体抗性机制的基础上,针对噬菌体的裂解性生活循环的不同阶段,已设计出很多工程噬菌体防御系统。工程噬菌体防御系统主要包括噬菌体编码的抗性、反义RNA技术、自杀陷阱及限制/修饰系统的应用等。 限制修饰系统普遍存在于原核细胞中,在保护细胞免遭外源病毒侵染方面具有重要作用。其机制主要通过限制酶识别并切割在特定位点没有得到甲基化修饰的外来DNA起到防御功能,而宿主的DNA由于在识别位点被甲基化而得到保护。cglI基因复合体是一种在谷氨酸棒杆菌染色体中发现的Ⅱ型限制修饰基因系统,编码一个甲基化转移酶和一个限制性内切酶。 为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题,本论文对cglI基因复合体用于构建抗噬菌体菌株的可行性进行了研究。利用PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体,构建重组质粒pJL23-cglI转化大肠杆菌。在探索cglI基因复合体在大肠杆菌中克隆的有效方法基础上,研究了cglI基因复合体在构建抗噬菌体菌株中的作用,并就cglI基因复合体对重组菌株生长代谢的影响做了初步评价。 研究表明,在大肠杆菌中克隆cglI基因复合体,载体和宿主的选择是决定克隆成功的重要因素,实验在McrBC缺陷的大肠杆菌HB101中成功克隆了cglI基因复合体;定性和定量实验结果均表明,利用cglI基因复合体构建的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性;携带cglI基因复合体的重组质粒pJL23-cglI对钝齿棒杆菌的生长和代谢产谷氨酸量基本没有影响。连续传代培养实验结果显示cglI基因复合体的存在能够增强质粒的稳定性。 本研究证实了cglI基因复合体用于构建抗噬菌体菌株的可行性,为从根本上解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法,同时,为cglI基因复合体用于构建大肠杆菌基因工程菌创造了有利条件,也为cglI基因复合体的应用研究开辟了新途径。