海藻酸钙/明胶微胶珠的制备及在神经干细胞培养中的应用

【摘要】：神经干细胞作为一种在临床治疗神经退行性疾病和神经损伤等疾病方面具有很有潜力的干细胞类型,目前存在着来源有限导致其数量不足以实现大规模应用的障碍。传统的体外扩增方法包括神经球悬浮培养和贴壁培养法,存在扩增速率不高,且不能很好模拟活体真实环境等缺陷而越来越显示出其局限性。 海藻酸钙微胶珠作为一种细胞固定化的载体和技术手段,具有价格低廉,操作简单、固定化条件温和,营养基质和代谢产物等物质扩散阻力小,生物相容性好等诸多优点。当前,海藻酸钙微胶珠技术在细胞的体外扩增和体内移植等领域已经得到普通重视和应用,但其作为细胞载体应用于神经干细胞包囊的相关研究还很少。 明胶是一种天然的高分子材料,其结构与机体细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)结构相似,具有良好的生物相容性,在生物医学领域有着广泛的应用。本研究使用海藻酸钠和明胶作为基质材料制备了海藻酸钙/明胶微胶珠,以期获得一种和当前的细胞载体相比更有利于细胞生长增殖的培养体系。 为了探讨这种复合材料微胶珠应用于神经干细胞体外培养和扩增的可行性,首先用自制的穿刺力测试仪研究了海藻酸钠,明胶和CaCl2浓度等不同制备条件对微胶珠耐穿刺强度的影响；并研究了微胶珠耐培养基的浸泡强度性能。为了检测此种微胶珠的渗透性能,以微胶珠为对象建立了扩散模型,研究了葡萄糖和BSA在微胶珠中的扩散情况,并模拟得到了葡萄糖在微胶珠中的扩散系数与海藻酸钠,明胶和CaCl2浓度的关系方程。通过综合分析强度和扩散性能等参数,得出静态培养最佳的制备参数为：海藻酸钠：1.5%；明胶：0.5%；CaCl2：4%。 其次,本研究采用优化后的制备参数对神经干细胞进行了包囊培养,并比较了包囊培养前后神经干细胞在形态和nestin表达情况。结果显示海藻酸钙／明胶微胶珠与神经干细胞有良好的生物相容性,包囊培养11d后收获的细胞nestin阳性,经血清处理后可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,表明仍保持神经干细胞特性。同时对比了不同包囊密度神经干细胞的增殖倍数,确定了最佳包囊密度约为1.5 x 105 cells.mL-1；此外,还系统检测了包囊培养神经干细胞的耗氧速率,葡萄糖消耗以及表面抗原的变化情况等参数,为微胶珠技术应用于神经干细胞的体外规模化动态培养探索了工艺参数并提供了理论依据。