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菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

李楠楠  
【摘要】:本文将菊粉酶基因通过同源重组整合到酿酒酵母染色体上,筛选得到了能够产生菊粉酶的酿酒酵母基因工程菌株,并对其菊粉酶的产生和菊芋粗原料的同步糖化发酵生产乙醇进行了研究。 以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了单拷贝整合菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶(Phosphoglycerate kinase, pgk)启动子,构建重组表达质粒pHO/p-inu和pHO/pgk-inu。经Not I线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊粉酶基因的阳性菌株HI6/1-HI6/10及HPI6/1-HPI6/3。实验结果表明HI6/6及HPI6/3的菊粉酶活力较高,分别为86.0 U/mL和23.8 U/mL,是出发菌株的4.6倍和1.5倍。进而以粗菊芋粉生料为底物进行了乙醇发酵,当浓度为200g/L时,重组菌株H16/6和HPl6/3的发酵终点乙醇浓度分别为55g/L和52g/L,糖醇转化率分别为0.495和0.453,达到理论值的96.9%和88.6%。菊芋批次补料发酵实验结果表明,当粗菊芋粉浓度为200g/L,发酵24 h后补加至280g/L时,发酵基本上在48 h达到终点,H16/6及HPl6/3的乙醇分别为74.5g/L和77.5g/L,均高于出发菌株,菊粉酶的酶活一直在10~25 U/mL范围内。菊芋发酵罐实验结果表明,在3 L发酵罐中,当粗菊芋粉总浓度为280g/L时,两株菌分别在60 h左右达到发酵终点,最高乙醇浓度达到80 g/L左右,残糖降至25g/L左右,发酵液中还原糖的浓度保持在5g/L,菊粉酶的活性仍然维持在10~20 U/mL。 以rDNA为整合位点,构建了多拷贝整合菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。利用PCR法扩增得到了pgk启动子基因、K. marxianus中的不带自身启动子的菊粉酶基因inu和用于介导重组表达的基因rDNA,并将其依次连接到载体pFA6a中,构建了多拷贝整合表达载体pF A6a-rDN A-pgk-inu,将其进行线性化后电转入S.cerevisiae 6525的感受态细胞,筛选得到了性能较好的两株菌6525/rDNA-13和6525/rDNA-14。实验结果表明,6525/rDNA-14菌株的最高酶活达23U/mL,6525/rDNA-13菌株的最高酶活也超过了20 U/mL,均高于出发菌株。批次补料发酵实验结果表明发酵过程基本在48 h达到终点,其中转化子6525/rDNA-14的最高乙醇浓度为72.5 g/L,6525/rDNA-13的最高乙醇浓度为69.5 g/L,乙醇产量均高于出发菌株67g/L。


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