神经干细胞玻璃化冻存及其生物学特性的研究

【摘要】：神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)的低温冷冻保存对于通过移植NSCs治疗急、慢性脊髓损伤以及多种神经系统疾病具有广阔的临床应用前景。为改善NSCs的冷冻保存效果,本课题拟对体外培养的NSCs的玻璃化冻存方案进行优化,并分析其冻存后的生化特性。 本文根据NSCs体积的变化确定了渗透平衡时间,将冷冻保护剂(Cryoprotective agent, CPA)分别于常温(23°C)、低温(0°C)下分六步导入单细胞悬液中,随后进行玻璃化冻存实验。台盼蓝与CCK-8分别用于检测细胞活率及增殖能力。流式细胞仪与Hoechst 33342/Ca/PI荧光染色用于更直观地检测冻后细胞的活率。Annexin V/PI与免疫组化分别检测冻后细胞凋亡及分化情况。尝试用蛋黄代替二甲基亚砜(DMSO),设计一种新型低毒性CPA。通过记录NSCs在NaCl溶液中的渗透反应,计算出水分对于细胞膜的渗透系数(Lp),从而为三参数的确定提供了重要参考数据。 实验结果显示,低温(0°C)条件下CPA的导入平衡时间大致为常温(23℃)的一倍。六步导入玻璃化冻存的NSCs复苏后经台盼蓝染色显示,常温、低温导入条件下其冻后活率分别能够达到72.5%、76.3%,CCK-8生殖情况检测结果显示,与未经处理的对照组相比,冻后细胞生长放缓3-4天。流式细胞仪检测以及Hoechst 33342/Ca/PI荧光染色显示冻后细胞回收率为72%,在后续培养过程中及时换液可避免出现分化并使细胞达到较高活率。AV/PI细胞凋亡检测结果表明冻存细胞的早期凋亡率为12.4%,中、晚期凋亡率为34.6%。免疫组化检测显示随着传代次数的增加,NSCs干细胞特性逐渐趋于不明显,但冻存前后相比无显著性差异。由改进的经验公式与实验数据计算出Lp=0.2133。神经球长期保存效果不理想,经过14个月的液氮保护,细胞活率检测结果仅为19%,但继续培养可实现一定程度增殖。而通过CPA的优化实验发现,蛋黄并不能够代替DMSO有效保存NSCs。