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基于宏基因组的芳烃加氧酶获取及特性研究

苟敏  
【摘要】:纯培养技术无法完全再现微生物的自然生存环境,使得可培养的微生物只占微生物总数的1%,严重阻碍了人类对微生物多样性的认识及对微生物资源的开发。宏基因组学技术避开了传统的微生物分离培养过程,直接研究环境样品总DNA,开启了获取未培养微生物信息的大门。本论文旨在利用宏基因组学技术,建立活性污泥宏基因组中芳烃加氧酶的获取策略,并结合实验室前期利用纯培养技术获得的芳烃加氧酶信息,对不同筛选策略进行综合评价,研究内容如下: 利用不同方法提取活性污泥宏基因组DNA,即溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、试剂盒法、CTAB法及琼脂糖包埋法,以为芳烃加氧酶的筛选提供高纯度、高质量的大片段DNA。结合单因素法与表面响应法确定影响溶菌酶-SDS-蛋白酶K法的显著因素:预处理缓冲溶液与DNA沉淀剂的类型、CTAB浓度、SDS浓度、溶菌酶浓度及37℃水浴时间;并获得最佳DNA提取条件为:TENC作为预处理缓冲溶液,异丙醇作为DNA沉淀剂,沉淀时间40min,1.5% CTAB,0.5 mg/mL溶菌酶,37℃水浴1.4 h; 2% SDS,200μg/mL蛋白酶,55℃水浴2.5 h,此条件下DNA的最大产量为170μg/g(污泥)。然而,经过优化的溶菌酶-SDS-蛋白酶K方法、试剂盒法及CTAB法提取的宏基因组DNA片段均偏小。随后采用琼脂糖包埋法提取DNA,该过程剪切力小、DNA损失少、获得的宏基因组DNA片段可达1.9 Mb,能够满足构建Fosmid基因组文库的需求。成功构建活性污泥Fosmid文库,文库库容为5,280个克隆,平均插入片断长度为35-40 kb,覆盖了约200 Mb的宏基因组DNA。对文库克隆进行限制性内切酶分析,分析结果显示:文库中插入的DNA片段具有较高多样性,有利于后续功能基因的筛选分析。 采用不同的筛选策略,包括宏基因组DNA直接PCR、文库活性筛选与序列筛选,从宏基因组DNA及Fosmid文库中获取芳烃羟化加氧酶与断裂加氧酶。结果表明:利用活性筛选难以获取芳烃羟化酶,可能是由于芳烃羟化酶为多组分蛋白,异源表达比较困难。同时,设计了一种简单高效的序列筛选方法,从文库中成功筛选到1个阳性克隆(命名为pCC3B),获得206 bp的苯酚羟化酶基因保守区序列。对活性污泥宏基因组DNA直接PCR,扩增到2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的部分序列,大小为719 bp。 结合TAIL-PCR、反向PCR与Clontech试剂盒三种染色体步移策略,扩增克隆pCC3B中苯酚羟化酶基因的侧翼未知序列,获得4,760 bp的序列全长,该序列登录GenBank,注册号为:HQ334893。氨基酸序列分析显示:苯酚羟化酶含有KLMNOP六个组分,与已知相应组分的序列最高同源性为44%-77%,表明来自宏基因组的苯酚羟化酶具有一定新颖性。大亚基的系统进化分析显示该基因属于亲和常数较低的group I,这类基因往往是污水处理系统中的优势基因。然而,经纯培养分离到的苯酚羟化酶多具有较高的亲和常数,表明宏基因组学技术具有获得新型优势功能基因的潜力。 将苯酚羟化酶基因克隆到表达载体pET28a(+)后,有4个碱基发生了突变。经突变修复,苯酚羟化酶基因在大肠杆菌中诱导表达,重组细胞不具有转化苯酚的能力。SDS-PAGE结果显示:苯酚羟化酶的6个组分未能完全表达,所表达的蛋白多为不溶的包涵体,降低诱导温度无法改善苯酚羟化酶的活性。同时,对苯酚羟化酶的启动子及核糖体结合位点序列进行分析,发现它们与纯培养来源的苯酚羟化酶相应序列存在很大的差异。由此推测:这种新颖的基因结构、组分的不完全表达以及包涵体的形成,可能共同导致重组苯酚羟化酶活性的丧失。 采用TAIL-PCR扩增到2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因897 bp的全长序列,命名为bphC_meta,该序列登录GenBank,注册号为:HQ334892。序列分析表明:BphC_meta属于1型外二醇双加氧酶的1.3.A亚族,其氨基酸序列与Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707及Burkholderia xenovorans LB400的相应蛋白有99%的相似性。将bphC_meta克隆到表达载体pET28a(+)后,有1个碱基发生了突变。经碱基修复后,BphC_meta在大肠杆菌中成功表达,金属依赖性实验初步证实BphC_meta以Fe(Ⅱ)为辅助因子。利用亲和层析法从重组大肠中分离纯化BphC_meta至电泳级,亚基分子量约为32±1 kDa。纯酶动力学分析表明,BphC_meta的酶催化反应符合底物抑制模型,对底物的催化选择性顺序为:2,3-二羟基联苯3-甲基邻苯二酚邻苯二酚,BphC_meta对4-甲基邻苯二酚及4-氯邻苯二酚均无活性。以2,3-二羟基联苯为底物时,酶反应的最适pH为9.0(Tris-HCl缓冲溶液),最适温度为40℃。为了更好地揭示BphC_meta的结构与功能的关系,利用分子对接将上述5种底物成功对接到BphC_meta的活性位点,获得的酶-底物结合能趋势与酶动力学结果一致。对接结果显示,取代基的类型及位置决定了底物与BphC_meta的Fe-O距离(酶的金属中心Fe原子与底物两个羟基O原子的距离),从而使得BphC_eta对取代邻苯二酚表现出不同的亲和能力。 以芳烃加氧酶为案例,对基于宏基因组技术的三种获取策略进行分析比较。同时,结合本实验室前期利用纯培养技术获得的芳烃加氧酶信息,从基因信息量、时间、成本、目的基因的新颖性及表达可行性等几个微生物资源开发过程中的关键性因素入手,对宏基因组学技术及纯培养技术进行综合评价。本论文的研究思路可为未培养微生物的探索策略提供有价值的参考,同时为生物修复及化工合成提供宝贵的新型酶资源。


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