亚洲玉米螟几丁质合酶基因表达与生理功能研究

【摘要】：几丁质是昆虫表皮,气管,头壳,前肠,后肠,胃,腺体分泌形成的外骨骼以及中肠上皮细胞形成的围食膜中的重要成分。昆虫几丁质合酶催化N-乙酰葡萄糖胺多聚化形成不可溶的几丁质,是昆虫蜕皮和变态发育过程中几丁质生物合成的关键酶。由于几丁质并不存在于高等动物或高等植物中,因此几丁质合酶是设计环境友好杀虫剂的理想靶标,具有重要的研究价值。 昆虫几丁质合酶可分为两类,即A类和B类。其中A类几丁质合酶(简称CHSA)在不同的发育时期和不同的组织中都发挥功能,目前已知编码CHSA的基因CHSA存在一个可变剪切位点从而产生2个同工酶,分别定位于表皮与气管。而B类几丁质合酶(简称CHSB)主要在昆虫进食期的中肠中表达,不存在可变剪切形式。因各个组织中的几丁质组成不同,目前未知组织特异的几丁质生物合成是如何实现的。 本论文以重要农业害虫亚洲玉米螟为对象,研究其编码的两类几丁质合酶。重点对A类几丁质合酶(CHSA)是否存在更多的可变剪切位点,其转录产物的表达模式和生理功能以及B类几丁质合酶(CHSB)的重组表达和其表达产物的细胞定位进行深入研究。论文取得的主要结论包括： 1)获得亚洲玉米螟A类几丁质合酶(OfCHSA)的cDNA序列(EU376026)和gDNA序列(EU563936)。序列分析表明其含有9个保守的基序,在催化过程中发挥不同的功能。首次发现OfCHSA除了19号外显子存在可变剪切,其2号外显子也存在可变剪切。这个新的可变剪切位点在其它昆虫中尚未报道。依据这一线索,我们在同为鳞翅目的家蚕的基因组数据库中也发现该可变剪切外显子。序列分析发现2号外显子产生的可变剪切产物各自具有独立的启动子,并对蜕皮激素20E的刺激具有不同的响应速度； 2) Real-time PCR结果表明OfCHSA基因主要在新生成卵中,幼虫-幼虫蜕皮过程,幼虫成蛹过程和蛹发育到成虫的过程中表达,说明该基因参与这些过程的几丁质生物合成。其表达具有很强的组织特异性,在表皮中的表达量要显著高于中肠。RNA干扰结果表明A类几丁质合酶在昆虫蜕皮及成蛹过程中负责表皮中几丁质的合成。注射蜕皮激素20E到亚洲玉米螟体内,Real-time PCR结果表明A类几丁质合酶的表达水平显著上调； 3)通过real-time PCR和RNA干扰实验进一步研究OfCHSA两个可变剪切位点产生的四个可变剪切外显子的功能。结果表明在不同的玉米螟发育过程中它们表达模式并不相同,具有各自的特点。它们的RNA干扰结果表明它们在昆虫发育过程中发挥的功能并不相同； 4) RT-PCR和20E诱导实验表明OfCHSA通过两个位置的可变剪切可以产生四种不同的转录产物,这四种转录产物在昆虫的发育过程中发挥不同的功能。其中外显子2a相关的转录产物作为主要的转录产物行使几丁质合酶的功能,2b相关的转录产物能够很快地响应20E的诱导作用； 5)获得了亚洲玉米螟中B类几丁质合酶OfCHSB的cDNA序列(DQ294306)和gDNA序列(EU258740)。其转录起始位点之前同样存在一个启动子,并在启动子核心区发现参与蜕皮激素调控的转录因子BR-C和E74a的结合位点。Real-time PCR研究表明获得的OfCHSB主要在昆虫进食期的中肠中发挥功能； 6)对OfCHSB的重组表达研究表明,在酿酒酵母细胞中,OfCHSB及其突变体都能够有效的表达。与GFP融合表达的重组蛋白在酵母细胞中大部分定位于类似内质网的结构中。在昆虫中肠细胞CF203/2.5中,OfCHSB及其突变体能够获得表达,通过免疫荧光分析发现重组蛋白部分存在于类似高尔基体的微囊结构中,这种结构可能类似酵母中的chitosome,参与几丁质合酶的运输。