多环芳烃降解菌的筛选、降解机理及降解性能研究

【摘要】：多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类典型的持久性有机污染物,具有高毒性、高生物富集性和难以降解等特点。PAHs污染环境的修复一直是环境科学技术领域的研究热点,其中微生物修复因具有成本低、无二次污染等优势而具有较大的应用潜力。自然界中存在着丰富的降解菌源,但在PAHs污染点,由于污染物分布不均及传质效率低等局限,进化成高效PAHs降解菌需要漫长的过程。本论文以高浓度的菲和芘为外界环境压力,从化工厂处理污水的活性污泥中筛选高效降解菌,监测菲或芘选择压力下菌群组成及对PAHs降解能力的动态变化,从中获得了两个能以菲或芘为唯一生长底物的高效PAHs降解菌群。从中分别挑选出两株高效降解菌株,对其降解机制进行了系统研究。论文的主要研究内容和结果如下： 1.分别采用4g/L的菲和芘为唯一碳源,经过10次传代驯化培养,从活性污泥中获得了组成和降解性能相对稳定的两个高效PAHs降解菌群,分别被命名为菲菌和芘菌。在传代驯化过程中,采用PCR-DGGE监测菌群组成的动态变化,结果显示最初的污泥样品中含有丰富的菌群,但在高浓度菲或芘的持续环境压力下,随着驯化代数的增加,菌群的数量逐渐减少,组成变得相对稳定。菲菌和芘菌驯化的难度和菌群的组成及PAHs降解能力均有很大差别。第一代菲菌的驯化仅用了5-7天,而第一代芘菌的驯化用了近1个月的时间；在菌群的组成上,菲菌主要由Acidovorax sp.、Pandoraea sp.、Pseudomonas sp和Enterobacter sp等组成。而芘菌主要由Achromobacter sp.、Empedobacter sp和Pseudomonas sp等组成。在PAHs的降解能力上,芘菌对高环PAHs的降解能力优于菲菌,对等浓度的16种PAHs,7天内,芘菌能够降解其中的11种,其中对萘、二氢苊、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘8种PAHs的降解率为100%,对苯并(a)蒽的降解率为36%,屈的降解率为29%,苯并芘的降解率为13%；而菲菌在相同降解条件下,对其中的10种有降解能力,对萘、二氢苊、苊、芴、菲5种PAHs的降解率为100%,蒽的降解率为87%,荧蒽的降解率88%,芘的降解率66%,苯并(a)蒽的降解率为22%,屈的降解率为11%,基本不降解苯并芘。此外,两个混菌在人工污染土壤中均显示出对PAHs较好的降解能力。 2.为了研究菲菌和芘菌的降解机制,分别从中筛选出以菲为唯一碳源的高效降解菌株Pseudomonas sp. JM2和以芘为唯一碳源的高效降解菌Pseudomonas sp. Jpyr-1。研究发现,JM2菲降解基因簇位于质粒DNA上,通过设计一系列简并引物进行基因扩增、测序,解析了该菌菲双加氧酶至2-羧基苯甲醛脱氢酶的全套降解酶基因序列,将其与14种已知的PAHs降解菌降解基因进行序列比对,发现与Alcaligenes faecalis AFK2有96%的同源性。结合检测到的邻苯二甲酸代谢产物分析,推测该菌株与产碱杆菌AFK2类似,通过邻苯二甲酸途径降解菲。在Jpyr-1降解芘的过程中检测到四种中间代谢产物菲-4-羧酸、1-羟基-2-萘甲酸、邻苯二甲酸和3,4-二氢二醇邻苯二甲酸,参考其它芘降解菌的代谢途径,推测Jpyr-1经由邻苯二甲酸途径降解芘。以Jpyr-1质粒为模板,通过设计简并引物,扩增出芘双加氧酶的α和β亚基基因序列。序列比对显示,该双加氧酶α亚基基因序列与革兰氏阳性菌分支杆菌Mycobacterium sp.6PY1的相应基因有90%的相似性。 3.设计了一系列两种PAHs共存体系,研究不同结构PAHs对菲降解菌JM2和芘降解菌Jpyr-1降解能力的影响。研究发现：芴、蒽或者荧蒽的存在对JM2降解其它PAHs均起到不同程度的抑制作用,而菲则起到促进作用。两种PAHs共存体系对Jpyr-1降解能力的影响在降解初期24h内,与JM2的规律相似,即芴、蒽和荧葸对芘的降解起到了抑制作用,而菲的存在明显的促进芘的降解。但在144h后,除了芴的存在一直抑制芘的降解外,荧蒽对芘降解的抑制作用明显降低,而蒽对降解则有所促进。 通过上述一系列研究,采用高浓度的PAHs作为环境选择压力,获得了高效PAHs降解菌群,特别是对高环PAHs具有较强降解能力的芘降解混菌；以降解菌群中的高效降解单菌为例,研究了其对菲和芘的代谢途径,对其降解机制进行了解析；在此基础上,进一步考察了PAHs组成对其降解的影响规律。上述一系列研究结果将对PAHs降解菌在环境修复中的应用提供重要依据。