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时间分辨荧光生化分析用新型铕配合物荧光标记物

张琳  
【摘要】:利用稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光生化分析技术由于具有灵敏度高、背景荧光干扰小等优点而在临床免疫分析、核酸杂交分析及生物成像分析等方面得到了广泛的应用。作为该技术发展的基础试剂,具有优良荧光性质的新型稀土荧光配合物生物标记物研制是该领域的一个重要课题。本学位论文研究分别设计合成了几种新型的基于铕荧光配合物的生物标记物,在充分表征各种标记物荧光性质的基础上,建立了这些标记物在时间分辨荧光生化分析中的应用方法。 设计合成了三种带有氯磺酰基活性基团的新型四齿β—二酮类配位体BHHBCB、 BPPBCB及BTBBCB,其与铕(Ⅲ)离子的配合物与牛血清白蛋白(BSA)结合后在水溶液中的荧光发光量子产率及荧光寿命分别为40.0%、0.52ms;36.1、0.49ms及34.0%、0.48ms,用于时间分辨荧光测定的检测下限分别为2.5x10-13mol/L、2.8x10-13mol/L及4.6x10-13mol/L。以配合物BHHBCB-Eu3+为标记物制备了BHHBCB-Eu3+标记的链霉亲合素,并对人前列腺特异抗原(PSA)及鼠隐孢子虫分别进行了时间分辨荧光免疫测定及时间分辨荧光显微成像测定,证明了新型标记物在高灵敏度时间分辨荧光免疫分析及病原微生物成像分析中的实用价值。 利用BHHBCB-Eu3+进一步与2-(N,N-二乙基苯胺-4-基)-4,6-(二吡唑-1-基)-1,3,5-三嗪(BPT)配位后可形成可见光激发三元配合物BHHBCB-Eu3+-BPT的性质,将BHHBCB-Eu3+-BPT与硅烷化试剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷共价键合后在微乳液体系中制备出了具有可见光激发性能及长荧光发光寿命的硅胶基质纳米铕荧光生物标记物。将纳米标记物与转铁蛋白键合后用于人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的时间分辨荧光显微成像测定,证明了其在可见光激发时间分辨荧光活细胞成像测定中的应用价值。 采用将三元配合物BHHBCB-Eu3+-BPT直接共价键合在BSA分子上的方法制备出了具有良好水溶性、可见光激发且可用于生物标记的铕配合物-BSA结合体BSA-BHHBCB-Eu3+-BPT。(?)将BSA-BHHBCB-Eu3+-BPT与叶酸键合后用于HeLa细胞及RAW264.7细胞的时间分辨荧光成像测定,证明了其在基于细胞表面叶酸-叶酸受体亲和作用的癌细胞时间分辨荧光识别成像测定中的有用性。


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