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转基因絮凝斜生栅藻的构建和自絮凝斜生栅藻细胞絮凝的研究

郭锁莲  
【摘要】:微藻可以用于CO2减排、污水处理和生物能源生产,对社会经济的可持续发展具有重大意义。但由于微藻细胞个体小,表面携带电荷以及培养浓度低等特点,使得微藻采收成本高居不下。理想的微藻不但应有良好的经济价值,最好还具有细胞絮凝能力,利用其细胞絮凝特性进行采收,会大大降低采收成本。 斜生栅藻不但可以作为饲料饵料,也可用于水体修复,还可用于生物柴油生产。但目前国内外对其分子生物学和遗传学研究还很少,缺少高效遗传转化方法。本文以斜生栅藻FSP-3为实验材料,建立了高效遗传转化体系,实现了酵母絮凝基因的成功表达,并证明了酵母絮凝基因可赋予栅藻细胞絮凝的特性。此外,还研究了天然自絮凝栅藻AS-6-1的细胞自絮凝特性,探讨了细胞自絮凝机理,研究内容和结果如下: 首先,对实验藻株进行无菌处理,这是进行微藻生理、生化以及遗传学研究的关键和前提。通过离心洗涤和稀释平板法除去藻液中的霉菌,再利用溶菌酶/SDS并结合抗生素法除藻液中的细菌,通过镜检及无菌检验,未见有细菌或霉菌存在,证明有效地去除了斜生栅藻FSP-3和AS-6-1中的杂菌,为后续研究工作提供了可靠的实验材料。在此基础上,对获得的无菌藻株进行培养条件的优化,分别考察了接种量、温度、表面光照强度及初始pH对藻细胞生长的影响。斜生栅藻FSP-3的最适培养条件为1×106cells/mL的接种量,28℃培养,6000lx的光照强度和初始pH为6.0-6.5;而斜生栅藻AS-6-1最适合生长的培养条件为:1×106cells/mL的接种量,30℃培养,6000lx的光照强度和pH为6.5的初始pH。在优化的培养条件下,斜生栅藻FSP-3和AS-6-1的生长情况均得到了明显的改善,不但生物量积累增加,而且多糖、蛋白质、总脂等胞内组分的含量也显著地提高。 以游离斜生栅藻FSP-3细胞为受体,采用电击法将含有CaMV35S启动子、报告基因gfp、选择标记基因cat的载体pCAMBIA1302-CAT导入藻细胞中,并对电击转化的相关参数进行了优化,结果表明在质粒浓度为50μg/mL,渗透液浓度为0.2mol/L,脉冲时间为2ms,脉冲电压为2kV的条件对斜生栅藻FSP-3进行转化,转化效率高达494±48/106受体细胞,而且转化子可以稳定传代10个月,得到的转化效率和遗传稳定性是目前微藻遗传转化研究中较高水平。进而,利用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性和定量检测报告基因gfp在转化子中的表达,证明所选用的载体元件包括启动子CaMV35S、报告基因gfp、选择标记基因cat在斜生栅藻FSP-3遗传转化体系中均有效可用。同时采用PCR, Southern blot以及RT-PCR方法对转化子进行了分析,从DNA和RNA水平上证明了载体pCAMBIA1302-CAT成功地导入斜生栅藻FSP-3细胞中,并将T-Border之间的区域随机整合到栅藻FSP-3基因组中。由此建立了斜生栅藻FSP-3高效稳定的遗传转化体系,并为外源基因的导入奠定基础。 将含有酵母絮凝基因FLO1的表达载体pCAMBIA1302-CAT-FLOl导入斜生栅藻FSP-3细胞中,筛选得到具有絮凝性状的阳性转化子,并通过荧光显微镜和扫描电镜从细胞水平上观察到由于酵母絮凝基因FLO1的导入,引起了藻细胞絮凝的现象。利用PCR、RT-PCR对转化子进行了分析,证明了酵母絮凝基因FLO1成功导入斜生栅藻FSP-3细胞中并进行了有效地表达,从而赋予了转化子细胞絮凝的特性。通过转基因藻株与野生型藻株的生长代谢情况进行研究,发现外源基因的导入表达对栅藻细胞生长的并不显著。由此证明酵母的絮凝基因可在微藻中进行表达,并赋予微藻自絮凝性状。 通过比较天然自絮凝斜生栅藻AS-6-1和转基因絮凝斜生栅藻FSP-3-FLO1,发现二者絮凝形态和絮凝性能存在较大差异:转基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝颗粒较大,表现出良好的自沉降性能,而天然絮凝微藻AS-6-1对淡水游离藻栅藻FSP-3和小球藻CNW-11具有良好的絮凝沉降能力。另外,天然自絮凝藻AS-6-1絮凝性能具有良好的温度耐受性和pH稳定性,而且不受金属离子螯合剂EDTA和糖的影响,具体原因与其絮凝活性物质的性质有关。转基因絮凝藻FSP-3-FLO1絮凝性能表现出高温和pH的敏感性,被EDTA、蛋白酶K解絮以及被甘露糖、半乳糖抑制的现象,其原因归结为转基因栅藻FSP-3-FLO1的絮凝性状是由于表达了外源酵母絮凝蛋白而引起的,絮凝蛋白的稳定性和活性直接影响了其细胞絮凝的性状。 研究表明天然自絮凝斜生栅藻AS-6-1的絮凝活性物质是多糖,其中中性糖、酸性糖和氨基糖的质量分数比为16:9:1,单糖组成中较高的甘露糖含量和较大的分子量等结构特征均与其絮凝活性有关。该絮凝物质对淡水藻栅藻FSP-3和小球藻CMW-11具有良好的絮凝活性,添加浓度0.6mg/L时絮凝效率可达到88%,并具有较好的热稳定性。 本文建立的斜生栅藻的高效遗传转化方法为斜生栅藻的分子育种和利用其作为生物反应器生产蛋白等高值产品奠定了基础。絮凝微藻的构建和天然微藻的絮凝研究,为利用细胞絮凝采收微藻的应用奠定基础。


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