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南极磷虾胰蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

王琨  
【摘要】:南极磷虾属于甲壳动物门真虾总目的磷虾目,因为生活在南极洲水域而得此名。南极磷虾资源十分丰富,生物量巨大。和大多数水生生物一样,南极磷虾具有自溶的特征,体内存在十分高效的酶消化系统。该系统能够迅速降解各种蛋白质、多糖,所以说南极磷虾是一个非常值得研究的蛋白酶源。因此从南极磷虾体内纯化出一种新的蛋白酶具有重要的意义。 本论文试图从南极磷虾体内分离纯化出一种胰蛋白酶,希望通过本研究建立起一套从南极磷虾中分离纯化胰蛋白酶的方法,为今后科学研究和工业应用奠定相应的理论和应用基础。本论文还进行了一些南极磷虾胰蛋白酶酶学性质的研究,如温度、pH条件、金属离子、蛋白酶抑制剂对该胰蛋白酶活性的影响。本文还研究了该纯化酶的酶促反应动力学常数和相关活性功能基团,以期为今后该南极磷虾蛋白酶的应用和深入的理论研究提供基础理论数据。 南极磷虾粗酶液经过40-50%饱和度硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow禺子交换层析以及HiTrap Benzamidine Fast Flow亲和层析三步分离纯化手段,最终得到一种电泳纯胰蛋白酶,其亚基分子量为20.0kDa。 该酶是一种中温蛋白酶,其最适温度在40℃左右。但在相对较低的温度25℃时,仍具有较高的酶活。但是该酶热稳定性较差。在低于40℃温度范围内可以基本保持稳定。该酶的最适pH在7.0左右,但在一个较宽的pH值范围内具有活性。同时该胰蛋白酶在偏碱的环境下比较稳定,在酸性环境下酶活受到强烈抑制。Mg2+、Ca2+、K+对南极磷虾胰蛋白酶活性都具有一定的激活作用,而Al3+、Cu2+、Zn2+对该纯化南极磷虾胰蛋白酶活性有强烈的抑制作用。 丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂苯甲基磺酰氟以及胰蛋白酶专一性抑制剂苯甲脒对该纯化南极磷虾蛋白酶具有强烈的抑制作用,说明该蛋白酶是一种丝氨酸类胰蛋白酶。高浓度的EDTA对该酶也有一定的抑制作用,说明该酶可能具有某些金属蛋白酶的性质。 以BApNA为底物,该南极磷虾胰蛋白酶的米氏常数(Km)和催化常数(Kcat)分别为0.108mmol/L和2.62s-1。 组氨酸残基、色氨酸残基是构成该胰蛋白酶酶活性中心的必需基团。精氨酸残基、氨基以及巯基可能与酶活性相关,但不是必需基团。


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