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Limnonectes Fragilis皮肤抗氧化肽的分离纯化、基因克隆及结构功能研究

高久香  
【摘要】:活性氧自由基是有氧呼吸动物生理代谢过程后的产物,其化学活性极强,可与几乎任何物质发生强烈反应。在正常的生理过程中,自由基被适当抑制,然而若病理状态下调控紊乱会严重危害机体,导致许多重大疾病。而生物体在长期进化过程中,也形成了高度的防御和保护机制。两栖类尤其是蛙类生存环境恶劣,皮肤脆弱且裸露,易受紫外辐射,且皮肤兼有呼吸功能,容易受到氧化损伤。两栖类独特的生存环境和漫长的进化过程,使得其皮肤被赋予独特的抗氧化机制,能有效防止氧化损伤对皮肤造成的伤害。 本文选取生活在长日照,高温高湿地带的脆皮大头蛙(Limnonectes fragilis)为研究材料,用以研究其皮肤是否存在独特的抗氧化体系,并试图探究其抗氧化机理。通过超滤离心和反相高效液相层析,对脆皮大头蛙皮肤分泌物进行分离纯化,鉴定出两种具有ABTS·+正离子自由基清除活性多肽,并通过Ed man降解法测序分别为:VKRRGQDCIHGFCSD (15个氨基酸残基)和GQFNDKRWIPFG(12个氨基酸残基),属于全新家族的抗氧化肽,被命名为Frigilin-A1和Frigilin-B2. 为进一步对其基因序列进行分析以及发现更多抗氧化肽家族,本研究构建了脆皮大头蛙皮肤cDNA文库,通过抗氧化肽家族基因的保守序列设计引物,克隆得到47种抗氧化肽cDNA序列,编码21种成熟肽,隶属11个抗氧化肽家族,其中14条属于新型抗氧化肽。 我们选取了结构完全特异的Frigilin-A1、Frigilin-B2,以及据核酸序列推测出的,与已知序列相似度最低的Odorranain-Q-Lf (APIRMWYMYRKLTDMEPKPVA)进行了化学合成,并进行了一系列结构和功能分析。结果发现三种抗氧化肽具有非常好的ABTS·+自由基正离子清除活性、DPPH自由基清除活性、还原力(Fe3+)活性和脂质过氧化抑制活性,且几乎不存在溶血和细胞毒性。对三条肽的二级结构、三级结构研究分析,结果表明三条抗氧化小肽具有规则的二级结构,与暴露的还原性位点,揭示了Frigilin-A1、Frigilin-B2与Odorranain-Q-Lf不是通过酶作用方式进行自由基的清除。 最后,我们对抗氧化肽前体信号肽(Signal pep tides)、间隔肽(Space peptides)、成熟肽(Mature peptides)核酸序列进行初步遗传进化分析,发现抗氧化肽不同区域存在不同的进化趋势,成熟肽区受到达尔文正选择压力和具有加速进化的趋势。


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