乙酸胁迫耐性基因挖掘及高活性酿酒酵母构建

【摘要】：酿酒酵母对环境胁迫耐受性是其工业生产应用的重要性能之一。良好的耐性可保持较好发酵活性,并促进细胞回用,因此,研究酿酒酵母对多种环境胁迫因素的耐性机理,进一步选育耐性良好的菌株,对提高酿酒酵母在生物燃料、食品及精细化学品生产中的应用具有重要意义。此外,乙酸是木质纤维素原料预处理过程产生的主要抑制性物质,高浓度乙酸对酿酒酵母细胞的生长和发酵具有强烈抑制作用,成为制约纤维素乙醇高效生产的关键因素之一。因此,提高酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性对提高纤维素乙醇发酵效率至关重要。本课题组前期研究表明,发酵培养基中适量添加硫酸锌可以显著提高酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性。为了深入探究硫酸锌添加提高乙酸胁迫耐受性的分子机理,挖掘与乙酸胁迫耐性相关的新功能基因,本文对乙酸胁迫条件下实验组(添加硫酸锌)和对照组(未添加硫酸锌)细胞进行了代谢物谱测定和全局转录组分析。结果表明,添加硫酸锌影响了细胞膜及膜转运蛋白的功能,如负责编码羧酸转运蛋白的基因ADY2、ATO2和JEN1在实验组细胞中显著下调。此外,添加硫酸锌也影响了中心碳代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢的中间代谢物含量以及相关基因表达量,如6-磷酸葡萄糖、丙氨酸和还原型谷胱甘肽等物质含量增加,参与嘌呤代谢调控的基因ADE1、ADE1和ADE17显著上调等。添加硫酸锌还影响了胞内锌指蛋白编码基因的表达量,如PPR1和SET5,这些基因可能在全局调控水平上影响细胞代谢。根据组学分析数据,分别选择转运蛋白、嘌呤代谢及调控基因作为可能的关键基因,研究了这些相关基因对酿酒酵母乙酸耐受性的影响。首先发现,在酿酒酵母中敲除ADY2提高了菌株在乙酸、过氧化氢和甲酸胁迫条件下的生长性能,其最大比生长速率比对照菌株分别提高了 39.55%、23.41%和15.86%,但是在无胁迫条件下生长和对照无显著差别。ADY2敲除突变体BYady2在3.6g/L乙酸和混合抑制物(5.3 g/L乙酸、1.3 g/L糠醛和0.5 g/L苯酚)条件下的发酵效率显著高于对照菌株BY4741,其乙醇生产强度分别提高了 14.66%和4.64%。同时在工业酿酒酵母Sc4126中敲除ADY2也有类似效果。深入研究发现,作为乙酸进入细胞的转运蛋白,Ady2p编码基因的敲除降低了胞内乙酸含量,其由对照菌株的0.39g/gDCW降低到0.34 g/gDCW,同时还提高了细胞膜完整性,从而提高菌株的乙酸耐受性。其次,过表达嘌呤代谢关键基因ADE1,ADE13和ADE17提高了酵母菌株在乙酸和过氧化氢胁迫条件下的生长性能。在5 g/L乙酸胁迫条件下过表达菌株BADE1,BADE13和BADE17在35 h内都可结束发酵,而此时对照菌株中仍有3.95 g/L的残糖,其中菌株BADE17的发酵性能最好,其在23 h便可结束发酵。在含有抑制物的模拟水解液中,过表达菌株BADE1,BADE13和BADE17发酵效率也比对照有所提高。探究机理发现,ADE1,ADE13和ADE17过表达可提高胞内ATP含量以及抗氧化物酶SOD的活性,另外ADE17过表达还使胞内GSH含量提高了 105.94%,因此嘌呤代谢三个关键基因过表达促进了 ROS的清除,提高了细胞活性。另外,PPR1和SET5过表达菌株BPPR1和BSET5在乙酸、过氧化氢和高温胁迫条件下的生长性能好于对照菌株,且在乙酸胁迫条件下的发酵效率高于对照菌株。在玉米秸秆水解液中PPR1和SET5过表达使得乙醇的生产强度分别提高了 18.41%和18.34%。对过表达菌株进行深入分析,发现过表达PPR1和SET5增加了胞内能量供应,提升了胞内抗氧化酶活性,同时还上调了胁迫相关转录因子编码基因HAA1,YAP1和MSN4的相对表达量,从而从多角度调控赋予细胞耐受性提高的性能。Set5p是酿酒酵母组蛋白H4甲基化酶,但对其锌指结构的作用目前尚未见报道。本文对Set5p锌指结构域进行突变,研究其对Set5p功能的影响。结果发现锌指结构域的缺失降低了细胞在乙酸胁迫和氧化胁迫条件下的生长性能,其生长速率分别比对照菌株的降低了 42.53%和35.02%,提示锌指结构域对Set5p蛋白提高乙酸胁迫耐性和氧化胁迫耐性具有重要影响。最后,利用iTRAQ技术检测了乙酸胁迫条件下Set5p过表达对胞内蛋白表达的影响,发现467个蛋白的表达量发生显著变化,其中上调的有380个,下调的有87个。功能聚类分析后发现,,SET5过表达提高了糖酵解途径和磷酸戊糖途径相关蛋白的表达量,从而有利于乙醇的生产和为提高胁迫耐性提供能量。同时,还提高MAPK途径和TOR/RAS途径蛋白的表达,进而有利于细胞对乙酸胁迫、氧化胁迫、渗透胁迫和饥饿胁迫的积极响应。此外,Set5p过表达影响了酿酒酵母蛋白的合成、折叠和转运能力,同时加快了对错误折叠蛋白的响应,保证细胞生长与代谢过程的高效和稳定。本文研究结果为进一步深入研究酿酒酵母胁迫耐受性的相关作用机理,选育胁迫耐性良好的工业乙醇酵母,提高纤维素乙醇的发酵效率提供了参考。