改造酿酒酵母内源基因表达提高木糖利用和乙酸胁迫耐受性

【摘要】：木糖是木质纤维素原料水解液中最主要的五碳糖成分,其利用有助于提高木质纤维素生物转化效率,然而广泛用于多种生物燃料和生物基化学品生产的酿酒酵母缺乏有效的木糖利用途径,必须通过代谢工程改造才能利用木糖。虽然已对木糖利用重组酵母的构建进行了多年的研究探索,但木糖发酵能力差的问题仍然比较突出。此外,木质纤维素原料预处理过程中产生多种抑制酿酒酵母生长和发酵的物质,其中乙酸是主要抑制物成分,且酵母在木糖发酵时对乙酸的敏感性比在葡萄糖条件下更高。因而,提高酿酒酵母菌株的木糖代谢能力和乙酸胁迫耐受性是选育高效发酵菌株的关键。近期研究表明,酿酒酵母中涉及转录调控、线粒体功能相关以及MAPK信号通路等的多个内源关键基因的突变或表达水平变化对木糖利用具有重要影响,但内源基因对酿酒酵母木糖利用的影响机理还不清楚。因此,对影响木糖利用的关键内源基因进行深入探索,有利于揭示酿酒酵母木糖利用的全局调节机制,提高菌株选育效率。首先,本研究比较了多个酿酒酵母菌株,包括实验室酵母、工业酵母和自然界分离的野生酵母菌株等的混合糖发酵能力和环境胁迫耐受性。发现一株分离自甘蔗渣中的野生酿酒酵母菌株YB-2625具有较好的混合糖利用能力,在80 g/l葡萄糖和20 g/l木糖的培养基中发酵96 h时消耗15.2 g/l木糖,而实验室模式酵母S288c仅可消耗7.6 g/l木糖,因此推测野生酵母菌株可通过长期自然选择调整其碳源利用相关的代谢调控网络。其次,利用转录组测序(RNA-Seq)比较了 YB-2625和模式酵母S288c在混合糖利用过程中全局基因转录的差异。对混合糖发酵阶段和纯木糖利用阶段分别进行比较转录组分析,发现与实验室酵母S288c相比,野生酵母YB-2625的内源木糖代谢基因(XYL2和XKS1),糖异生以及TCA循环相关基因有更高的表达水平,可能有利于菌株的木糖利用。此外,野生酵母YB-2625胞内与葡萄糖抑制相关的转录调控因子编码基因,包括MIG1、MIG2、MIG3和HXK2转录水平明显下调,推测该菌株可通过缓解葡萄糖抑制作用促进木糖的利用。此外,YB-2625菌株在混合糖发酵过程中,与抗氧化酶相关的基因(CTT1、CAT1、SOD2和PRX1)转录水平更高,与之对应的是在木糖发酵阶段YB-2625 过氧化氢酶(CAT)酶活水平为 S288c 的 1.9 倍,此外,在混合糖和纯木糖发酵这两个阶段,其胞内ROS水平分别比对照低43.3%和58.6%,推测氧化胁迫耐性的提高有助于木糖利用。进一步实验证明,过表达抗氧化酶基因CTT1和PRX1可增加菌株以木糖为唯一碳源的生长能力,过表达菌株的木糖消耗分别增加了 13.5%和18.1%。除了转录水平,基因组序列突变分析也可提供影响木糖利用和胁迫耐受性的相关基因信息。因此进一步对YB-2625基因组进行了测序,并分析与木糖利用和环境胁迫耐性相关的功能基因。YB-2625基因组全长11.84Mb,与模式酵母S288c相比较,存在多个YB-2625特异性的基因以及与碳代谢和环境胁迫相关功能基因的突变。其中组蛋白乙酰化酶编码基因RTT109在YB-2625菌株中存在错义突变位点,在转录组分析中该基因表达也下调,因此对该基因的功能进行了深入研究。在实验室菌株BY4741中敲除RTT109基因后提高了菌株的乙酸耐受性,在添加了 5.5 g/l乙酸的抑制条件下进行100 g/l葡萄糖发酵,RTT109敲除突变株延滞期由对照菌株的60h缩短至12h,乙醇生产强度由对照菌株的0.39提高至0.60g/l/h。敲除突变体中胁迫响应相关的基因,如CTT1、GSH1、SOD1和GPX1等转录水平均有所提高。在乙酸胁迫条件下发酵至稳定期时RTT109敲除突变体胞内的总SOD酶活力为115.45 U/mg蛋白,而对照菌株酶活仅为79.63 U/mg蛋白,同时RTT109敲除突变体GSH-Px活力也比对照菌株高77.1%。但在YB-2625中敲除RTT109未观察到环境胁迫耐性的差别,推测该基因的作用可能具有宿主遗传背景依赖性。利用YB-2625作为宿主菌株构建木糖利用重组酿酒酵母,初始构建的菌株YB-2625 CCX木糖利用率低且副产物木糖醇产率高,因此在rDNA位点进行木糖醇脱氢酶(XDH)基因多拷贝整合过表达,通过筛选得到的YB-73菌株在混合糖发酵过程中木糖醇产率降低了 64.6%,乙醇产量提高了 13.9%。对基因组测序和比较转录组数据进行深入分析,发现染色体重构复合体亚基编码基因NGG1具有点突变,且在木糖利用阶段基因转录明显下调。敲除NGG1可明显增强木糖重组菌株在5 mM H2O2氧化胁迫条件下的生长,更为重要的是,NGG1敲除可提高重组菌株的木糖发酵能力,在40 g/l纯木糖中发酵96 h后,木糖残糖量为4.9 g/l,对照菌株的残糖量为12.7 g/l。同时,NGG1敲除突变体的乙醇产量相比于对照菌株提高了 84.6%。进一步对NGG1敲除菌株木糖利用提高的分子机理进行初步探索,发现NGG1敲除可提高木糖脱氢酶基因XYL1的表达,同时可提高氧化胁迫相关基因SOD1和CTT1的表达水平,推测NGG1可通过调控碳代谢关键基因表达与酵母细胞的胁迫耐受性基因表达提高木糖利用。本文的研究为进一步深入探讨酿酒酵母内源基因表达调控和宿主遗传背景影响木糖利用的机理,开发新的代谢工程改造靶点,选育木糖代谢和乙酸耐受性提高的重组菌株,进而提高木质纤维素原料的生物转化效率提供了基础。