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生物3D打印组织工程血管及其细胞毒性研究

秦帅  
【摘要】:以中老年人心脑血管疾病和婴幼儿先天性心脏病为代表的血管类疾病一直是威胁人类身体健康的重大医学难题之一,该类疾病的治疗很大程度上依赖于组织工程血管及复杂血管网络的3D(3 Dimension)打印。本文介绍了一种以明胶-海藻酸钠-碳纳米管(Gelatin(Gel)-Sodium Alginate(SA)-Carbon nanotubes(C))混合水凝胶体系作为3D打印原材料/生物墨水,在挤出式生物3D打印机中另行引入步进电机组件,利用打印喷头定向挤出水凝胶和旋转圆筒模型有效配合横向打印出血管支架的方法,后续将小鼠表皮成纤维细胞接种到空心圆管支架内外壁,体外构建了具有生物活性的组织工程血管。首先使用共混法定量配制了Gel-SA-C混合生物墨水,并对混合生物墨水进行了一系列物理化学性能分析。其中SA与Ca~(2+)可发生离子交联,当SA浓度高于2%且交联剂中Ca~(2+)浓度在1%~5%之间时方具有可打印性。粘弹性和稳态粘度检测表明,明胶的引入在打印前期可为打印支架提供良好的定形作用,海藻酸钠的交联过程对所打印结构的力学性能和稳定性至关重要。温敏性检测结果表明纯海藻酸钠组分无明显温敏性,而明胶基墨水粘度则随温度降低而明显增高,其临界凝胶温度为18℃。SA及其与Ca~(2+)交联产物的红外光谱检测显示2940 cm~(-1)、890 cm~(-1)和950 cm~(-1)波数特征吸收峰随Ca~(2+)浓度增加逐渐减弱,指示了交联发生的位点,而明胶基混合墨水组中1530 cm~(-1)特征吸收峰的出现显示了明胶的成功引入。进而介绍了挤出式生物3D打印机的改装工艺和血管支架打印工艺。将步进电机套装组装到Bio-Architect~?-Pro生物3D打印机中逐步实现血管支架的打印,之后将支架浸泡在4%的CaCl_2交联剂浴中交联30 min。使用红色墨水灌注实验表明,所打印的血管支架结构连续完整,且无细微缝隙。批量打印制备的系列血管支架内径分别为3 mm、4mm和5 mm,平均壁厚0.5 mm,管长可达7~10 cm。Gel-SA、Gel-SA-0.5%C和Gel-SA-1%C三组冻干支架的孔隙率分别为89.25%,55.55%和19.01%,吸水率分别为334.02%、272.28%和149.01%,溶胀平衡时间分别为6h、12h和18h。三组中Gel-SA-0.5%C组的抗拉伸强度最强,表明适量掺杂碳纳米管能有效增加复合支架的机械性能,且在PBS缓冲溶液和I型胶原酶溶液两种液体环境中均表现出一定的耐受力和较强降解能力。SEM观察冻干后血管支架中跨尺寸孔隙的存在有利于成纤维细胞的黏附伸展和营养物质的运输和渗透。将成纤维细胞接种到3D打印矩形中培养后进行死活染色,两周内支架形态良好,细胞铺展局部粘连成片。定量实验表明,混合墨水体系经3D打印后生物相容性较好,细胞毒性较小。随后采用组织团块法进行Balb/c新生24 h幼鼠表皮成纤维细胞的原代和传代培养。由生长曲线可知,幼鼠表皮成纤维细胞的分裂能力较强,一周即可扩增一个数量级,HE染色表明细胞形态饱满。最后构建了多层细胞生物活性血管,扫描电镜和死活染色观察均表明血管构建物内细胞能均匀平铺于内外管壁,细胞粘连成片,生长状态良好。CCK检测实验表明,三组第7天细胞存活率分别为86.64±4.50%、80.58±6.70%、65.23±5.50%,其毒性等级分别为I级,I级和II级,接种7天后细胞增殖速度较快,且细胞呈现良好的生长态势,复合材料的生物相容性较好,适量掺杂碳纳米管对体系细胞毒性的影响较小,构建物能满足仿生血管生物活性要求。


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