紫杉醇/siRNA共递送系统的构建及其抗非小细胞肺癌活性研究

【摘要】：肿瘤的化学药物治疗与基因治疗是从不同途径或不同作用机理抑制肿瘤生长,两种治疗共同作用于肿瘤时,可有效提高治疗效果,实现化疗药物和基因联合治疗的关键是将不溶于水的抗肿瘤药物和亲水性带负电荷基因共递送至肿瘤细胞,使二者发挥协同抑制肿瘤的作用。现有的共递送系统还存在血液循环稳定性和肿瘤靶向性差等问题,限制了其临床应用。为此,本论文基于课题组合成的阳离子类脂构建了三种新型共递送系统PTX/PSur/QLD、PTX/siVEGF/FAPL 和 PTX/siVEGF/FAPLS,研究了他们共载药物和基因的能力及其在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)联合治疗中的应用。论文主要研究内容分为三部分。1.共递送系统PTX/PSur/QLD的构建及体外抗癌活性。用鱼精蛋白(protamine,P)压缩survivinsiRNA(siSur)形成纳米颗粒PSur,再以季铵盐型阳离子类脂N-[1-(2,3-氧十二烷基氨基甲酰)丙基]-N,N,N-三甲基碘化铵(QLip)为递送系统骨架分子,嵌入助类脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE,D),构建共载紫杉醇(PTX)和siSur的纳米共递送系统 PTX/PSur/QLD。共递送系统 PTX/PSur/QLD 的摄入率(68%)高于 PTX/siSur/QLD(48%),证明鱼精蛋白压缩确实能提高siRNA的递送效率。体外survivin蛋白表达检测以及肿瘤细胞增殖抑制结果证实,PTX/PSur/QLD中的siSur能够显著下调survivin蛋白表达,从而通过抑制肿瘤细胞的抗凋亡作用,增加肿瘤细胞对PTX的敏感性,进而发挥PTX和siSur对NCI-H460细胞的协同抑制作用。2.共递送系统PTX/siVEGF/FAPL和PTX/siVEGF/FAPLS的构建及体外抗癌活性研究。用多肽型阳离子类脂N,N-双十四烷氧酰胺乙基三聚鸟氨酸酰胺(PLip)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(FA-PEG2000-DSPE,FA)以及蔗糖酯(S)构建了两种pH响应型药物控释递送系统PTX/siVEGF/FAPL和PTX/siVEGF/FAPLS,用于共同递送PTX和干扰血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA(siVEGF)。以PLip具有的氨基甲酸酯键为pH控释开关,递送系统表现出pH敏感的控制释放行为,在pH 5.5(细胞内涵体)条件下PTX累积释放量是pH7.4处的2倍,缓释时间可达120h。此外,与不加蔗糖酯的PTX/siVEGF/FAPL相比,共递送系统PTX/siVEGF/FAPLS中的蔗糖酯提高了 PTX的缓释能力。体外模拟释放和共聚焦成像,验证了这两种共递送系统可以将PTX和siVEGF递送到肿瘤细胞中,并且通过pH响应实现PTX的缓慢释放,siVEGF成功逃离内涵体进入细胞质下调VEGF表达,蛋白沉默效率达到80%以上。肺癌的细胞增殖抑制和凋亡检测表明,PTX/siVEGF/FAPL和PTX/siVEGF/FAPLS可以诱导细胞凋亡从而抑制NCI-H460细胞的生长。3.共递送系统PTX/siVEGF/FAPL和PTX/siVEGF/FAPLS体内抗癌活性研究。皮下种植NCI-H460细胞建立荷瘤小鼠模型,尾静脉给药后,两种共递送系统能将PTX和siVEGF同时递送至肿瘤组织,且蔗糖酯嵌入到PTX/siVEGF/FAPLS骨架分子中能使其在血液循环中更稳定,延长了其在血液中的循环时间,结合叶酸靶向递送,可有效增加递送系统在肿瘤部位的蓄积。PTX/siVEGF/FAPLS在VEGF蛋白表达下调和肿瘤凋亡方面均优于PTX/siVEGF/FAPL,其可靶向输送siVEGF干扰肿瘤组织VEGF蛋白的表达,从而抑制血管的生成切断肿瘤的营养供给,增强肿瘤细胞对PTX的敏感性,促进NSCLC细胞凋亡,增强抑瘤效果。PTX/siVEGF/FAPLS组肿瘤的平均大小比Saline组小8.68倍,比游离PTX组肿瘤小7.00倍,比PTX/siVEGF/FAPL治疗组小3.46倍,表明以肽类脂为递送系统骨架分子并嵌入蔗糖酯构建的靶向共递送系统PTX/siVEGF/FAPLS,在NSCLC治疗中具有良好的应用前景。