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培养基因工程菌表达胸腺素α1融合蛋白的研究

程波  
【摘要】: 胸腺素α1(Thymosin α1,Tα1)是从牛胸腺制备物TF5(Thymosin fraction 5)中分离出来的一个酸性多肽,比原来TF5制备物的生物活性高 10-1000倍,可作为一种生物反应调节因子,也是一种针对T淋巴系统的免 疫增强剂,由于编码Tα1基因的核苷酸序列已经清楚,构建基因工程菌并 通过其大规模培养获得Tα1在技术上已经可行。 本论文通过摇瓶和发酵罐培养,研究了含有Tα1基因的重组pET32a质 粒的工程菌BL21的培养过程及菌体生长的动力学规律,高密度发酵中的流 加策略以及影响融合蛋白表达的因素。最终实现了基因工程菌的高密度培养 同时融合蛋白的高表达。 在摇瓶培养工程菌中,系统考察了LB、TH、2*YT等不同的培养基,不 同培养温度、摇瓶中培养基盛装量、添加不同浓度葡萄糖、葡萄糖的添加方 式、诱导剂(ITPG)用量、诱导时间等因素对工程菌生长和蛋白的表达的影 响。确定了最适生长温度为35-37℃和最佳表达温度为30℃,对数生长中期 诱导,诱导剂用量为0.4-0.5mmol/L,诱导时间为4-6h。其融合蛋白表达 量占菌体蛋白总量的26-28%。 在摇瓶培养的基础上,确定了分批发酵的基本培养条件。针对发酵过程 中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况,在B.Braun5L自控发酵罐中改变了 培养方式,进行了分批发酵和补料分批发酵。得到了最佳的培养方式:接种 量为10%时延迟期为2小时,在35℃时培养,降温到30℃诱导。在进入对数 期时以每小时15-20g/L的速率流加葡萄糖。在对数末期诱导前,补充一倍 的新鲜培养基,保证发酵液中糖浓度小于3g/L。最终使菌体的干重由原来的 4g/L增加到10g/L,融合蛋白表达量由小于10%增加到23.25%。为工业上 的应用打下了基础。 针对批式发酵,建立了工程菌的生长动力学模型,得到了工程菌动力学 和能学的四个参数,发现工程菌在对数生长期保持比生长速率为0.4-0.5/h 时生长状况最佳,在比生长速率在0.2-04/h时诱导,融合蛋白表达量最大。 从理论和实践上为基因工程菌的发酵和外源蛋白的表达提供了依据。


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