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大豆皂甙的提取、分离及酶解

田晶  
【摘要】: 本文以提高大豆皂甙的生物活性为目的,研究了大豆皂甙的提取、分离及酶解的方法,考查了大豆皂甙糖苷酶的产酶、发酵条件、分离提纯方法以及酶性质,并探讨了大豆皂甙在酱油发酵过程中的变化。 在大豆皂甙提取的研究中,在I.Kitagawa和K.Okubo等有机溶剂法提取大豆皂甙的基础上,建立了吸附层析法(国产大孔吸附树脂,商品号AB—8)提取和纯化大豆皂甙的方法。采用紫外光谱法测定大豆皂甙的含量,并通过Folin—酚法和3,5—二硝基水杨酸法测定洗脱液中蛋白和糖的含量,考查了乙醇浸泡浓度、流速、以及乙醇洗脱浓度对大豆皂甙提取的影响,得出最佳乙醇浸泡浓度为40%、最佳流速为6.3×10~(-3)m·min~(-1)、最佳乙醇洗脱浓度为50%。AB—8树脂的吸附容量为103.2mg·g~(-1),大豆皂甙的提取率为90%。所得皂甙纯度较高,是一种简便实用的大豆皂甙提取方法。 大豆皂甙的分离,采用硅胶柱层析法。用抽真空的方法来给柱子加压以实现快速、有效分离大豆皂甙。同时采用不同配比的洗脱剂依次洗脱大豆皂甙,改变了用同一配比洗脱剂洗脱的传统柱层析模式,这种方法尚未见报道。以200~300目的硅胶为固定相装柱,依次用氯仿:甲醇比为9:1、8.5:1.5、8:2、7.5:1.5的混合液为洗脱剂分离大豆皂甙,利用各种单体皂甙与硅胶间吸附情况及洗脱剂的不同,分离得到了Rf值为0.46(展开剂为氯仿:甲醇:水=36:25:6)的大豆皂甙单点。首次将高效液相色谱——质谱联用技术应用到大豆皂甙的检测中,证明柱分离得到的大豆皂甙单点是大豆皂甙中的一组——B组皂甙,包括皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,这对B组大豆皂甙的选择性应用具有重要的意义。 为了得到低糖链、高活性的大豆皂甙,并且提高大豆蛋白的质量,研究了大豆皂甙的酶解。在大豆皂甙酶解研究中,测定了八种霉菌对七种糖苷键的水解能力,这八种菌株均对α-半乳糖苷水解酶活力较高,其次是β-木糖苷、β-葡萄糖苷,对α-阿拉伯糖苷、β-葡萄糖醛酸苷、α-鼠李糖苷、β-半乳糖苷等水解能力则不一致。在八种霉菌中通过TLC分析,筛选出三种对皂甙糖苷水解活力强的菌株,分别为sp.848s、即.39s、sp.48s,用这三种菌株在不同时间和不同pH值与皂甙反应,通过TLC和HPLC分析,确定酶解最 大连理工大学博士学位论文 一 佳时间为 12h,最佳 PH值为 5。上述三种酶液均能水解皂贰变成低糖皂贰产 物及贰元。Sp.485菌所产酶液与B组大豆皂贰反应,所得产物的分子量为668 和 780,是B组大豆皂贰单体被水解后的低糖大豆皂贰,分子式为C。6H。60。·ZH。0 和 C。。H7。0;。。其中,分子量为 668的大豆皂贰是 3-氧{p{个g南葡萄糖醛酸基」 大豆贰元B带两个结晶水,是B组大豆皂贰水解掉一个和两个糖基的产物; 分子量为780的大豆皂贰,是3一氧一[a一L一毗口 鼠李糖基(1+2)p刀一毗 口葡 萄糖醛酸基」大豆贰元 B,是 B组大豆皂剃水解掉一个 a-L-0比哺阿拉伯糖基 的产物。 SP.485和 SP.8485菌产酶的最佳培养时间为 48h;SP.395菌产酶的最佳 培养时间为 36h。对SP48S、SP.8485和 SP.395菌所产的卜-葡萄糖昔酶进 行分离提纯的研究表明,利用高效液相制备色谱可以分离提纯混合酶液。其中, SP.485和 SP.8485菌所产i-葡萄糖昔酶均在40%左右的钠盐浓度下被洗脱下 来,收率分别为 3.0%和 3.6人 Sp.395菌所产 p-葡萄糖昔酶在 33%的钠盐浓度 下被洗脱下来,收率为 3.1巩对于 s卜48s和 sp.848s菌所产P-葡萄糖昔酶, 酶反应最适 PH均为 5.0,最适温度均为 40 OC,均在 PH3.0-PH7.0和 30 t-60 ℃范围内相对稳定:SP.395菌所产p-葡萄糖昔酶的最适pH、最适温度及… 稳定范围均与另两株菌相同,只是温度稳定范围更宽,为 20 C乃0 C。对 SP.485、SP.8485和 SP.395菌所产的酶经分离提纯后的相应酶蛋白,进行 SDS- 聚丙烯酚胺凝胶电泳,都得到电泳单点,其酶蛋白分子量分别为 34,000、31, 000和 50,000。 首次考察了酱油发酵过程中大豆皂贰组成和含量的变化。一方面,由于酱 油曲子中含有水解大豆皂贰糖基的酶,可以水解部分糖基,产生低糖链、高活 性的大豆皂贰;另一方面,大豆皂贰在酱油发酵过程中含量随时间增加而增加, 到一定时间后又下降,这一规律可以帮助人们在酱油生产过程中有效控制发酵 时间,得到含有更多大豆皂贰的对人们健康有利的酱油产品。通过对酱油制曲 过程中大豆皂贰的变化与大豆皂贰酶解惰况的对比研究,发现大豆皂贰在制曲 过程中产生的新皂贰与大豆皂贰酶解后产生的新皂贰很相似,说明大豆皂贰在 制曲过程中的变化机理与酶解作用机理相同,都是在水解酶的作用下将大豆皂 贰的糖基水解(得到 Rf值增大的产物)或在糖基转移酶的作用下得到糖基增 加的皂贰门f值减小的产物人


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