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白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究

侯红漫  
【摘要】:本论文以白腐菌木质素降解酶为研究对象,从十二株白腐菌中筛选产木质素降解酶能力强的菌株,利用层析技术将木质素降解酶分离纯化,并进一步了解该酶的基本酶学性质和特性,用于蒽醌染料SN4R的脱色研究,同时考察了产漆酶白腐菌对造纸碱木素的脱色能力。 所试白腐菌在限氮条件下未发现有锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的生成,主要产生的木质素降解酶为漆酶。其中产漆酶能力最强的是侧耳(Pleurotus ostreatus 324);次之为侧耳(Pleurotus ostreatus)青岛黑,杏鲍菇(Pleurotus eryngii),侧耳(Pleurotus ostreatus)5526;产漆酶能力较低的有香菇(Lentinus edodes9608),以及侧耳(Pleurotus ostreatus)中的792、G1、G5和鲍鱼菇;而杂色云芝(Polyporus versicolor),灰管层孔(Fomes lignosus),草菇(Votvariella volvcea)在此条件下不产漆酶。在富氮培养条件下,未发现有木质素过氧化物酶的生成,主要木质素降解酶为漆酶和锰过氧化物酶.在富氮培养条件下白腐菌产漆酶能力明显低于限氮条件下产漆酶能力,高浓度的氮对漆酶生产有抑制作用。 糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus 324)在限氮条件下产漆酶能力较强,本论文研究了该菌的产漆酶能力,并进行了酶学性质和应用性研究。白腐菌真菌Pleurotus ostreatus 324最佳产漆酶条件为:静置条件下培养,温度为30℃,培养基初始pH为5,三角瓶装液量为20ml/250ml。在所有测试碳源中,纤维二糖、阿拉伯糖为最佳碳源;在氮源中,有机氮要优于无机氮,如蛋白胨、酵母膏、酒石酸铵、尿素都是漆酶生产的良好氮源,当培养基C/N>10:1即高碳低氮培养条件下,有利于漆酶的形成;产酶培养基中添加0.5mmol╲L浓度的不同金属离子,其中Ca~(2+),Ca~(2+)有助于漆酶的产生;添加诱导剂ABTS(0.5-1mM/L)对漆酶的活性影响最明显,与对照相比可提高漆酶酶活5倍,约为410 U/ml。该酶产量明显高于国内外同类文献报道,白腐菌Pleurotus ostreatus 324是漆酶的优良生产者,具有很高的实际应用价值。 白腐菌Pleurotus ostreatus 324漆酶,经三步层析分离,纯化为电泳级,纯化倍数为26.5倍,回收率为38.3%。该漆酶单个亚基分子量为56.5kD,自然分子量为56kD。该酶在醋酸缓冲液中最适反应pH为3.5,最适反应温度为65℃,在醋酸缓冲液(pH5.0)中,反应温度低于50℃时,漆酶非常稳定;该漆酶能氧化ABTS和各种酚类化合物,尤其是对对位和邻位甲氧基取代酚的氧化能力强,羟基取代酚次之,而对氨基取代酚、阿魏酸和焦醅酚的氧化能力相对较弱;叠氮化钠对该漆酶有强烈的抑制作用。与其它真菌漆酶相比,无论是在分子量大小上,还是在酶学性质上都明显不同,可初步断定Pleurotus 大连理工大学博士学位论文 ostreatus 324漆酶为一新的真菌漆酶。 漆酶是一种含铜多酚氧化酶,可催化酚类化合物和芳香胺的氧化,在小分子介体物 质存在下,漆酶氧化范围可进一步扩大。葱醒染料活性艳蓝SN4R可被该粗漆酶(30U/m1) 直接脱色,脱色最佳pH值为4.0,40℃为最佳脱色温度,脱色时间为12小时,脱色率 为55%,但酶活与染料脱色率不呈正比关系。经一系列SN4R脱色的对比实验,发现纯漆 酶和小分子物质ABTS分别单独使用时,都不能使蕙醒染料SN4R脱色,当纯漆酶中添加 小分子介体物质ABTS时,可使SN4R脱色;显然葱醒染料SN4R不是漆酶底物,小分子还 原介体可介导漆酶与非酶底物染料之间的氧化作用,而使染料脱色。小分子介体物质 ABTS、对一甲氧基酚、黎芦醇的添加,有助于染料脱色率的提高以及脱色时间的缩短,添 加一定浓度的对一甲氧基酚或黎芦醇后,染料SN4RZ小时的脱色率可达8既以上。 白腐菌分泌胞外氧化酶一木素降解酶。这类氧化酶底物专一性不强,除降解木质素外 还降解大量的芳香族污染物。首先观察了四种白腐菌Pleurotus eryng王i,PolyPorus versicolor,尸leurotus口streatus和Fomesl妙osus在限氮和富氮培养基中振荡培养产木素过 氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的能力,由于尸leurotus ostreatus和尸leurotus eryng王i产酶 能力较强,用于碱木素的降解脱色效果较好,二者在限氮条件下n天对碱木素降解脱色 率为65%和72%。对于Pleurotus ostreatus犯4来说,0.69/L CaZ+有助于该菌体生物量的增 加,对其产酶影响不明显;10mg/L Mn2+有助于该菌锰过氧化物酶活性的提高;smg/L Cu2+ 可显著提高该菌产漆酶能力,10天可使碱木素的降解脱色率达到90%。


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