芽孢杆菌Q-12的鉴定及其抗菌活性物质的研究

【摘要】：据统计有80%以上的植物病害是由真菌引起的,大多数真菌在侵害农作物的同时,还产生真菌毒素危害人类健康,目前由真菌引起的植物病害的防治主要以化学农药为主,因而研究真菌的生物防治极为重要。从堆肥中分离到的菌株Q-12具有强烈抗真菌活性,本研究对Q-12菌进行了鉴定并对其发酵条件和所产生的活性物质作了研究。 Q-12菌的抗菌谱较广,几乎能够抑制所有的被试真菌,尤其能够强烈抑制葡萄白腐病菌、草莓蛇病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、玉米弯孢病菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄瓜菌核病菌、菜豆炭疽病菌、白羽纹病菌等植物病原真菌。此外,Q-12菌还能够抑制一些食品腐败菌如毛霉、黑曲霉、黄曲霉、串珠镰刀菌等。 通过对Q-12菌进行形态观察、革兰氏染色、芽孢染色发现其菌体呈短杆状,兼性厌氧且内生芽孢,为革兰氏阳性菌。API生理生化实验再次证明其为芽孢杆菌,并且与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的生理生化特性相近。16S rDNA同源性序列分析表明,Q-12菌与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的序列同源性均达到99%以上。为进一步确定Q-12菌的分类地位,又利用基因yyaR、yyaO、tetL、tetB在解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中排列顺序的差异,再次对该菌在分子水平上进行鉴定,结果表明Q-12菌为解淀粉芽孢杆菌。 探讨了碳源、氮源、牛肉膏浓度等对解淀粉芽孢杆菌Q-12生长及其产活性物质的影响,确定了其最适的培养基组成为葡萄糖5g/L、NH_4Cl 1g/L、牛肉膏0.8g/L、氯化钠5g/L,最适培养温度为33℃,最适培养pH为6.0,最适培养时间为30小时。Q-12菌的发酵产物不仅能够抑制真菌菌丝的生长,而且能够抑制某些产孢真菌如尖孢镰刀菌孢子的萌发,对有机溶剂、蛋白酶、热和pH值都有很高的稳定性,可望用于防治土传病害。 通过硫酸铵沉淀对解淀粉芽孢杆菌Q-12的发酵产物进行粗提,粗提物经阴离子交换层析后得到了四种不同的活性组分,并对其中的一种活性组分QA I再次通过凝胶过滤层析和半制备型反相高效液相层析进行了纯化,纯化后的样品经反相高效液相色谱检测为单一峰,说明纯度较高。然后又利用紫外、红外、核磁和质谱对活性物质QA I的结构进行了分析,结果表明:其分子量为1017.8Da,含有羟基,不含有苯环和多个共轭双键相连的体系,不为糖、蛋白或肽类化合物。