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短梗霉黑色素的分离提取及其结构分析

徐磊  
【摘要】:短梗霉(Aureobasidium pullulans)以产多糖而出名,而关于短梗霉产黑色素的研究目前鲜见报道。黑色素(melanin)是生物界中广泛存在的一种异源多聚芳香族化合物,具有生物半导体、清除自由基、防紫外线辐射、螯合重金属离子等功能,广泛应用于日用化妆品工业、食品工业、医药化工、农业等众多领域。为了利用短梗霉生产天然黑色素,本论文对短梗霉黑色素的理化性质、提取方法、结构分析以及培养条件进行了研究。具体研究内容及结果如下: 1、黑色素的发酵条件 通过单因素试验初步确定了短梗霉产黑色素的发酵条件和培养基成分以及Cu~(2+)对发酵条件的影响。在发酵时间120h,适宜温度30℃,摇瓶转速170r/min条件下确定了最适培养条件和培养基成分:初始pH值6.0~6.5;Cu~(2+)浓度为2×10~(-6)mol/L;接种量3%(v/v);300ml摇瓶装液量为50ml;葡萄糖、NaCl、硫酸铵质量分数分别为7.5%、0.04%、0.08%。 2、黑色素的理化性质 利用发酵法制得的天然色素符合黑色素的基本特征,具有较高的热稳定性,对紫外、可见光照射不敏感,并且对H_2O_2和苯甲酸钠有较好的耐受性及食品要求范围内的金属离子对色素稳定性影响都不显著,但是还原剂Na_2SO_3对其影响显著,故在应用过程中避免与还原剂的接触。 3、黑色素的分离提取 (1)正交试验确定了碱提酸沉法提取黑色素的最佳条件:1mol/L NaOH水溶液为提取剂;提取温度:70℃;料液比:1:1(V:V),酸化浸提液的最佳pH值为2~3。每100ml发酵液提取黑色素粗品为220mg。(2)采用DMSO萃取黑色素粗品,5000r/min离心10min取有机相,酸性甲醇(pH=2)沉淀有机相,双蒸水洗涤沉淀至中性作为黑色素纯品,通过紫外光谱和离子色谱检测,与传统方法的样品对比,样品含蛋白、多糖及其它杂质较少。 4、黑色素的结构分析 红外光谱分析表明,黑色素样品波长为3μm(约3333cm~(-1))、6μm(约1667cm~(-1))处有特征吸收峰;结合~1H NMR图谱分析表明:样品可能为芳环结构,含有氨基、甲氧基、羟基等基团。液相.质谱联用谱图分析更进一步的确定此黑色素含有酚羟基、羧基和吲哚环等官能团,是以5,6-二羟基吲哚-羧酸和多巴醌为结构骨架的多酚类聚合物。 5、黑色素与金属离子络合物的红外分析 短梗霉黑色素在不同的pH值条件下与金属离子相互作用,其红外光谱表明:金属离子与黑色素许多的羧基和酚羟基等基团紧密结合;随着pH值逐渐增大的情况下,黑色素与Fe~(3+)络合作用相比Cu~(2+)更强烈,黑色素在Fe~(3+)溶液中立即形成絮凝,推断黑色素含有更多的酚羟基。


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