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曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究

王严  
【摘要】: 植酸酶作为一种单胃动物饲料添加剂,其饲喂效果已经在世界范围内得到确认。但目前植酸酶在饲料中的推广应用还相当有限,究其原因主要有二:一是天然材料中植酸酶含量太低导致植酸酶生产成本过高;二是当前商业植酸酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。通过从自然界筛选具备良好饲用酶潜质的植酸酶产生菌,利用分子生物学技术获得植酸酶基因,再将基因高效表达在生物反应器中是解决上述问题的一个策略,业已成为植酸酶的世界性研究热点之一。 本研究从土壤中筛选出一株黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶产生菌和一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶产生菌,克隆了二者的植酸酶基因,并将其高效表达在毕赤酵母中,获得了性质优良的基因工程植酸酶。另外,本研究将烟曲霉植酸酶成功表达在烟草中,首次利用植物生物反应器生产这类耐热植酸酶,为其今后的生产开辟了一条新途径,同时,鉴于植物基因工程在解决作物有效利用土壤有机磷资源上所具备的潜能,对转基因烟草在磷胁迫条件下的生长状况也进行了分析。具体实验内容及结果如下: 1.利用植酸钙平板初筛和摇瓶复筛的方法,在30℃和45℃分别获得植酸酶产生菌WY-6和WY-2,酶活力均达到0.14U/mL。菌株WY-6所产植酸酶的最适pH为3.0,最适温度为55℃;菌株WY-2所产植酸酶的最适pH为5.5,最适温度亦为55℃。二者分别被鉴定为黑曲霉菌和烟曲霉菌,在中国工业微生物菌种保藏中心的菌种收录号为CICC 40700和CICC 40699。 2.通过PCR扩增的方法获得来源于黑曲霉WY-6和烟曲霉WY-2的植酸酶基因全序列,分别命名为phyA(GenBank accession no.AY745739)和fphyA(GenBank accession no.AY745738)。phyA全长1506bp,共编码467个氨基酸;fphyA全长1459bp,共编码465个氨基酸。由phyA所推导的氨基酸序列与黑曲霉NRRL3135植酸酶具有97%的同源性;由fphyA所推导的氨基酸序列与烟曲霉ATCC34625植酸酶具有91%的同源性,与黑曲霉NRRL3 135植酸酶具有66%的同源性。 3.将phyA克隆到表达载体pPIC9K中,电击转入毕赤酵母GS115,获得黑曲霉WY-6植酸酶基因工程酵母GS115/phyA。经甲醇诱导60h后,GS115/phyA的产酶达到最高峰,酶活力达到28.2U/mL,为出发菌株酶活力的200倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析三个分离步骤后,重组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为147U/mg,分子量约为67kDa;在pH2.5~6.5范围内均具有较高酶活性,两个最适pH分别为3.0和5.5;最适温度为55℃;以植酸钠为底物时的K_m为0.112mmol/L,K_(cat)为243/s;与胃蛋白酶以0.01的比率(pepsin/phytase,wt/wt)混合作用2h后,仍保留70.9%的残余酶活力。 4.将fphyA克隆到表达载体pPIC9K中,电击转入毕赤酵母GS115,获得烟曲霉WY-2植酸酶基因工程酵母GS115/fphyA。经甲醇诱导60h后,GS115/fphyA的产酶达到最高峰,酶活力达到16U/mL,为出发菌株酶活力的114倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析及凝胶过滤层析四个分离步骤后,重组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为51U/mg,分子量约为88kDa;仅在酸性范围内呈现酶活性,最适pH为5.5;最适温度为55℃;具有较高耐热能力,90℃处理15min后,保留43.8%的残余酶活力;可水解多种磷酸底物,其中对植酸钠的特异性最高,以植酸钠为底物时的K_m为0.114mmol/L,K_(cat)为102/s;与胃蛋白酶以0.1的比率(pepsin/phytase,wt/wt)混合作用2h后,仍具有90.1%的残余酶活力;蛋白二级结构受溶液pH值影响,在pH6.0时的α-螺旋含量最高(35.6%)。 5.将含烟草钙调蛋白信号肽序列的烟曲霉WY-2植酸酶基因组成型表达在烟草中。PCR鉴定和Southern杂交分析表明植酸酶基因已整合到烟草的基因组DNA中;RT-PCR和Western杂交结果说明植酸酶基因已成功转录并在蛋白水平上得到表达。转基因烟草经土培4周后达到了最高的植酸酶表达水平,其叶片中的植酸酶含量达到总可溶蛋白的2.3%,酶活力为野生型烟草的13倍。重组植酸酶的分子量约为63kDa;最适pH为5.5;最适温度为55℃;具有较高耐热能力,90℃处理15min后,仍保持28.7%的残余酶活力。 6.在烟草钙调蛋白信号肽的引导下,重组植酸酶由转基因烟草的根分泌到体外。水培40天后,转基因烟草培养基中的植酸酶含量达到烟草根分泌蛋白的2.012%,酶活力为野生型烟草的15.3倍。以植酸盐为唯一磷源的培养条件下,转基因烟草的生长状况明显好于野生型烟草,生长45天的转基因烟草的地上部干重、根干重、总磷含量分别为对照烟草的2.0、1.5、2.7倍。进一步分析培养基中植酸盐的消耗情况表明磷营养的提高与植酸酶基因的表达有关。


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