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环境因子对球等鞭金藻生长的影响

孙颖颖  
【摘要】: 本文以球等鞭金藻为对象,运用一系列单因素实验和正交实验,分析了常量元素,维生素和微量元素等营养条件以及温度,光照,pH和通气速率等环境条件与球等鞭金藻生长的关系,确定了球等鞭金藻培养的优化营养条件和环境条件;利用柱状光生物反应器和平板式光生物反应器培养球等鞭金藻,研究了培养条件以及补加营养,流加培养和半连续培养等培养模式对球等鞭金藻生长的影响,确定了球等鞭金藻高密度培养的工艺条件;采用乙酸乙酯萃取,Sephadex G-15凝胶过滤,制备薄层层析和C_(18)反相高效液相色谱等分离纯化方法成功地分离出一种微藻生长抑制物,确定了其化学结构,并对其性质和抑藻活性进行了定性探讨;此外,还在抗氧化剂对生长抑制物抑藻效应的抵制以及环境因子对球等鞭金藻胞外碳酸酐酶活性的调节,质膜氧化还原活性与胞外碳酸酐酶活性的关系以及某些抑制剂对球等鞭金藻无机碳利用的抑制作用等方面进行了探索,为球等鞭金藻高密度大规模培养提供理论依据。主要研究结果如下: 1、获得优化培养基配方和培养条件 培养基配方:NaNO_3,45.5 mg;KH_2PO_4,2.195 mg;Na_2SiO_3,0.8714 mg;NaHCO_3,20 mg;微量元素溶液1 mL(MnCl_2·2H_2O,15.8336 mg;CuSO_4·5H_2O,14.9808 mg;ZnSO_4·7H_2O,0.2013 mg;Na_2MoO_4·2H_2O,0.7295 mg;CoCl_2·6H_2O,23.795 mg;FeCl_3·6H_2O,482.7 mg;Na_2EDTA,0.665 g;1 L蒸馏水配制),维生素溶液1 mL(维生素B_1,100 mg;维生素B_(12),0.5 mg,1 L蒸馏水配制);1 L海水配制。 培养条件:温度25℃,pH 8.0,光强7500 lx,通气速率0.2 vvm。采用上述条件,在PhR-L20C光生物反应器中对球等鞭金藻进行了培养,其生物量产量达到1.3 g/L。 2、确定了优化的培养工艺条件 通过一系列的单因素实验和正交实验,在平板式光生物反应器中,光径,光强和通气速率分别为5 cm,7000 lx和0.375 vvm时是最佳培养条件。采用该优化条件对球等鞭金藻进行一次性培养,生物量产量达到2.2 g/L。同时还对流加培养,半连续培养和补加营养等培养工艺对球等鞭金藻生长的影响进行了研究,发现流加培养和半连续培养两种培养方式更适合该藻的培养。 3、获得了一种生长抑制物并确定了其化学结构 以球等鞭金藻高密度培养物的无细胞滤液对球等鞭金藻和其它微藻进行培养,发现了一种生长抑制物,研究表明该抑制物具有广泛的抗藻活性,不仅抑制自身藻细胞生长,而且抑制牟氏角毛藻等其它微藻的生长。随后对该生长抑制物的分离提取工艺进行了研究,其最适提取工艺为:pH2-3,提取时间3 h,提取料液比10:1,提取溶剂乙酸乙酯。在此基础上,运用乙酸乙酯萃取,Sephadex G-15凝胶柱层析过滤,硅胶G制备薄层层析和C_(18)反相高效液相色谱等分离纯化方法获得了该生长抑制物的纯品;采用紫外光谱,质谱,核磁共振碳谱和氢谱以及核磁共振二维谱等手段确定了其化学结构为1-羟基,丙二酸二乙酯-十二烯酸异丙酯(C_(22)H_(38)O_7),分子量为414。 深入研究发现,该抑制物能明显降低球等鞭金藻和牟氏角毛藻等微藻细胞内叶绿素含量,硝酸还原酶,过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,提高细胞内丙二醛含量和胞外可溶性蛋白质与多糖含量的比值,从而通过影响细胞的光合作用,细胞内营养平衡,细胞内活性氧浓度以及细胞表面的疏水性,对微藻细胞的生长产生强烈的抑制效应。此外,发现抗氧化剂能够明显抵制该生长抑制物对球等鞭金藻的抑制效应,其主要机理可能是抗氧化剂能够有效地清除生长抑制物胁迫下藻细胞内积累的活性氧,减轻藻细胞的膜脂过氧化伤害。 4、探索了细胞外碳酸酐酶活性与球等鞭金藻无机碳利用的关系 碳酸酐酶(CA)是CO_2浓缩机制组成部分,在光合CO_2固定中起着较重要的作用。我们的研究结果表明,氮,磷,Zn~(2+),无机碳,光强,通气速率和pH等因素均能调节球等鞭金藻胞外碳酸酐酶活性。此外,我们注意到细胞质膜氧化还原活性,乙酰唑磺胺(AZ)和乙氧苯唑胺(EZ)等对球等鞭金藻无机碳的利用有直接的影响,同时还发现DIDS (4′4′-diisothiocyanatostilbene-2,2-disulfonic acid)和SITS(4-acetamido-4’-isothiocyano-2,2’-stibene-disulfonate)等对球等鞭金藻无机碳的利用也有一定的影响,进而我们获知球等鞭金藻具有依赖胞外CA,膜ATP酶,带Ⅲ蛋白以及Na~+/HCO_3~-协同转运系统间接和直接利用HCO_3~-的能力。


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