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无载体无标记转植酸酶基因大豆的获得

高晓蓉  
【摘要】: 植物转基因技术的迅猛发展对传统的作物育种已产生了深刻的影响,然而,自从1998年有人提出转基因生物的安全性问题以后,转基因农作物的种植面积增长速度明显减慢。原因是由于以往的转基因操作中,转化的载体上不可避免的带有载体骨架序列、抗性标记基因、以及外源的启动子,这些因素可能造成转基因植物具有潜在的生物安全隐患。因此,转基因植物安全性问题迅速成为公众关心的焦点和制约转基因农作物产业化的瓶颈。随之产生的去除标记基因和载体骨架序列的新的植物分子育种方法成为植物转基因技术研究的热点。 本研究以半固体发酵方式培养泡盛曲霉(Aspergillus awamori)生产植酸酶,通过超滤、阴离子交换层析,凝胶层析步骤,分离纯化了植酸酶蛋白。SDS-PAGE结果显示该酶的分子量约为118kDa,糖基化程度为40.6%。酶学性质研究结果表明:泡盛曲霉植酸酶的最适反应温度为55℃,最适pH为2.5和5.5,37℃条件下以植酸钠为底物的K_m值为1.03nM,V_(max)为2.13μM/min。金属离子对酶活性影响的研究结果表明,EDTA基本不影响植酸酶活性,Ca~(2+),Mg~(2+),Mn~(2+)有轻微的抑制作用,Fe~(2+),Zn~(2+)抑制作用显著。对该酶的耐热性研究表明,在较高温度条件处理后,仍有较高残余酶活性,与当今商品化的植酸酶相比,有较强的耐热性。 利用PCR技术克隆了泡盛曲霉(A.awamori 3.324)植酸酶基因及其编码区全序列,命名为phyA(GenBank accession no.DQ192035)。phyA结构基因全长1515bp,其中含有真菌内含子特征保守序列。核苷酸和氨基酸序列均与丝状真菌的同源性较高,其中与无花果曲霉(A.ficuum)NRRL3135 phyA的核苷酸同源性为92.1%(不计内含子,二者的内含子序列相差很大),氨基酸同源性为95.9%;与A.niger963 phyA_2的核苷酸同源性为95%,氨基酸同源性为94%。该基因编码的植酸酶蛋白理论分子量为51042.8Da,共编码467个氨基酸,序列中存在组氨酸酸性磷酸酯酶的活性位点保守序列(RHGXRXP)和催化中心位点(HD)。根据信号肽序列的结构规则推断,N端的21个氨基酸为信号肽序列,由基因推导出的氨基酸序列上有10个潜在的糖基化位点。 构建了植物表达载体pBI121-phyA,通过农杆菌介导法将植酸酶基因导入模式植物烟草,获得卡那霉素抗性植株,通过PCR,Southern-blotting证明外源植酸酶基因已成功整合在烟草基因组上。对转基因烟草叶片的重组植酸酶活性分析表明植酸酶基因在烟草中获得高效表达。对烟草中的植酸酶酶学性质研究表明,重组植酸酶的最适反应温度与泡盛曲霉植酸酶的性质相同,耐热性略有下降,其中一个pH发生偏移。初步说明泡盛曲霉植酸酶基因能够在模式植物中得到正确表达。 利用PCR技术从植物表达载体pBI121-phyA上扩增获得无载体骨架序列、无抗性标记基因的含有植酸酶基因的最小线性表达元件,通过花粉管通道技术转化大豆。共对279朵花进行了转化,共获得99株T_1代植株。PCR检测结果表明,13株的扩增结果呈阳性,转化率为13%。473株T_2代个体的PCR结果显示,102株结果为阳性。对T_3代两个株系L14-11-2和L14-19-1部分植株的Southern-blotting结果分析表明,外源基因以低拷贝的方式整合在大豆基因组上。 RT-PCR分析表明,外源植酸酶基因已在大豆体内转录。测定了L14-11-2和L14-19-1两个转基因株系后代生长过程中植酸酶的积累情况。重组植酸酶的含量在大豆生长的第二周至第四周不断增加,随后的两周表达水平趋于平稳,在第七周开始有所下降。其中L14-19-1株系后代个体的植酸酶活性在第四生长周时达到最高,为150 U/mg蛋白,几乎是对照的3倍(56 U/mg蛋白)。在转基因大豆种子中植酸酶含量比对照平均提高100%。热稳定性分析表明,转基因大豆种子中植酸酶的残余酶活性在60℃,65℃和70℃时,分别保留70%,40%和10%,而对照样品在65℃以后几乎没有残余酶活性保留,明显高于未转基因大豆。Western-blotting分析结果表明,大豆体内表达的重组植酸酶的蛋白分子量大小为73 kD。 通过上述分析,证明外源植酸酶基因在大豆体内实现了遗传和表达,初步建立了一种新的植物分子育种转化体系——具有生物安全性的植物基因工程操作方法,已获得国家知识产权局的专利授权(专利号:ZL 02 1 328382)。目前,这转基因大豆的两个株系L14-11-2(命名为1411)和L14-19-1(命名为1412)已被国家农业部认定其生物安全等级为Ⅱ级,并批准进行中间试验。


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