口服微囊化卵黄免疫球蛋白（IgY）的制备及性能研究

【摘要】： 口服特异性卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin,IgY)可治疗由细菌或病毒引起的肠道疾病,具有安全无残留、不产生抗药性、服用简便等优点,是一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。但IgY在高强度的胃酸环境中易被胃蛋白酶降解,失去抗体活性。因此,如何避免IgY在胃中失活,而在小肠中稳定地发挥作用,是一个亟待解决的问题。针对这一问题,本论文采用微囊化技术包埋IgY,制备口服型IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊,从体外、体内两方面评价壳聚糖-海藻酸钠微囊作为IgY口服载体的可行性。 本研究以引起仔猪腹泻的最主要致病菌——产肠毒素大肠杆菌K88为抗原,免疫蛋鸡后获得特异性IgY。通过对获得高效价特异性IgY的最佳抗原浓度研究发现,K88菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于全菌;纯化的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于粗菌毛蛋白,其诱导的抗体效价最高可达1:480000;确定菌毛蛋白的最佳浓度为2 mg/ml,全菌的最佳浓度为10~(10)cfu/ml。 通过对IgY的分离纯化条件研究发现,盐析法提取IgY的最佳条件是将粗提的IgY经50%饱和度的硫酸铵盐析一次,再经14%(w/v)硫酸钠盐析一次,获得的IgY回收率可达46%,纯度可达77%;经超滤(100 kDa)后,最终获得的IgY冻干粉纯度为82%。 对IgY稳定性的研究结果表明,温度不超过70℃时,IgY具有良好的热稳定性;pH＜3时,IgY活性大部分丧失;IgY对胰蛋白酶有较好的抵抗力,但低pH条件下对胃蛋白酶十分敏感;冷冻干燥处理对IgY活性有不利的影响;-20℃和4℃环境中,IgY冻干粉具有良好的贮藏稳定性。 为保护IgY的口服活性,选用天然材料海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,利用气体吹喷制囊法,制备IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊。考察了成囊装置主要的物理条件对空白壳聚糖-海藻酸钠微囊粒径及形态的影响,确定制备微囊的最佳物理条件为:空气压力0.3m~3/h,,液面距8 cm,恒流泵速度4 ml/min,搅拌子转速200 r/min。此条件下制备的新鲜微囊球形圆整,平均粒径约1 mm,且粒径分布集中。在此基础上,探讨了主要反应条件对微囊的载药量、包封率、保护IgY在模拟胃液中的稳定性、以及微囊在体外的释放行为的影响。确定制备微囊的优化条件为:成囊溶液pH 3.5,壳聚糖浓度0.2%(w/v),CaCl_2浓度0.5%(w/v),海藻酸钠浓度2%(w/v),药载比25%,在此优化条件下制备的IgY微囊载药量高于20%,包封率高于75%,IgY在模拟胃液中2 h累积释放率小于10%,而在模拟肠液中4 h累积释放率大于80%。另外,ELISA和SDS-PAGE结果显示,IgY微囊在模拟胃液中可抵抗胃蛋白酶的降解,而且抗体的活性保持在70%以上。 将IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊用于断奶仔猪的攻毒治疗试验,结果表明,腹泻断奶仔猪服用IgY微囊后,病情很快得到控制,1 d后所有病猪得到治愈,而且体重增加最快;而未包埋的IgY冻干粉治疗效果低于微囊化IgY,3 d后所有病猪得到治愈。而对照组仔猪口服生理盐水,第1 d有腹泻症状的仔猪3 d后仍未见好转,体重下降。由此可见,IgY经壳聚糖-海藻酸钠微囊包埋后,可以很好的保护其在胃酸环境中的抗体活性,并且可于小肠中定点释放,能有效治愈断奶仔猪腹泻。 综上,本研究制备的IgY微囊,可保证IgY以较高的活性到达小肠,并在肠道中定点释放,稳定的发挥作用。其作为一种新型的口服动物保健产品,将具有良好的产业化前景。本研究也为其他口服生物活性物质的控释制剂开发奠定了基础。