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丁二酮产生菌的选育及代谢控制发酵研究

赵玲  
【摘要】: 本文的工作是在丁二酮发酵代谢途径及机制分析的基础上,以代谢控制发酵理论为指导,进行丁二酮高产菌株的选育、发酵条件的优化、代谢酶学研究及代谢机制分析。 以产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes,CICC 10293)为出发菌株,采用紫外线诱变,并结合亮氨酸平皿和丁二酮平皿筛选方法,获得耐高浓度底物-葡萄糖的高产丁二酮突变菌株,命名为UV-3。利用气相色谱测定代谢产物量,分析诱变前后菌株代谢途径中碳源的流向,结果表明突变株UV-3的丁二酮产量提高18.7倍,达到1.045g/L,乙偶姻产量降低48.4%,乙醇产量降低71.4%,乙酸产量提高34.6%,且遗传性质稳定。 基于Logistic和Luedeking-Piret方程,建立UV-3细胞生长动力学、底物消耗动力学和丁二酮生成动力学模型,得到动力学方程分别为:X(t)=0.0011e~(0.3953t)╱[1-(0.3953╱5.81)(1-e~(0.3953t))]、S(t)=100-0.0051×[X(t)-0.0011]-0.6594×5.81╱0.3956 ln[1-(0.0011╱5.81)(1-e~(0.3946t))]和P(t)=0.0034×5.81╱0.3956 ln[1-(0.0011╱5.81)(1-e~(0.3946t))]+0.0557(Xt-0.0011),实验数据的拟合度依次为99.4%、99.26%和98.75%。 优化后丁二酮发酵条件如下:培养基组成为葡萄糖10%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%,(NH_4)_2SO_4 0.01%,柠檬酸0.1%,MnSO_4 0.2%,MgSO_4 0.2%;500mL摇瓶培养条件为接种量10%,装液量150mL,培养温度37℃,pH 7.0,摇瓶转速180r/min;UV-3摇瓶培养60小时,丁二酮产量达到1.15±0.03 g/L;5L发酵罐发酵条件为接种量10%,装罐量3L,培养温度37℃,pH 7.0,培养30小时,丁二酮产量达到1.35 g/L。 丁二酮代谢途径中主要代谢酶的酶活分析表明:UV-3的乳酸脱氢酶、双乙酰还原酶和α-乙酰乳酸脱羧酶三种酶比活依次为0.024±0.002U/mg、0.036±0.002U/mg和0.087±0.007U/mg,均低于出发菌株10293;而出发菌株和突变株中的乙偶姻脱氢酶均低于0.001U/mg。乳酸脱氢酶、双乙酰还原酶和α-乙酰乳酸脱羧酶三种酶活最低的pH分别为7.0、7.0和7.5左右。温度为35℃左右时,乳酸脱氢酶酶活最低;温度范围35~40℃内,双乙酰还原酶酶活较低;α-乙酰乳酸脱羧酶酶活随温度升高逐步降低。Mn~(2+)对三种酶有抑制作用;Fe~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)对三种酶均有不同程度的激活作用;Co~(2+)对乳酸脱氢酶和α-乙酰乳酸脱羧酶有抑制作用,而对双乙酰还原酶有激活作用;Ba~(2+)、Ca~(2+)和Cu~(2+)强烈的激活双乙酰还原酶和乳酸脱氢酶活性,Cu~(2+)是α-乙酰乳酸脱羧酶的强抑制剂,Ba~(2+)和Ca~(2+)对α-乙酰乳酸脱羧酶无明显影响。通过主要代谢酶的酶学性质分析,确定产气肠杆菌突变株UV-3积累丁二酮的代谢途径是由α-乙酰乳酸的非酶氧化直接生成。


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