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Bacillus smithii产耐热菊粉酶的分离纯化及其化学修饰

刘彬  
【摘要】: 本文对实验室筛选的两株高产耐热菊粉酶的Bacillus smithii菌株,优化条件下进行产酶发酵,分离纯化得到耐热菊粉酶,研究其酶学性质,应用化学修饰的方法表征影响耐热菊粉酶活性的关键氨基酸组成,探讨其催化作用机理和耐热机制。 优化培养Bacillus smithii T4,离心收集发酵上清液,通过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、Sepharose Q-FF、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析得到纯化的菊粉酶,SDS-PAGE检测为单一条带,亚基分子量约为45.5KD,比酶活为881.6 IU/mg。酶学性质研究表明:该酶催化作用的最适温度为60℃,60℃和70℃的半衰期分别为8h和5h;最适pH为5.0,在pH4.5-7稳定性较好;以菊粉为底物时,米氏常数Km值为2.73mmol/L,没有转化酶活性,表明来源Bacillus smithii T4菊粉酶的底物专一性较好。而来源于Bacillus smithii T7耐热菊粉酶,比来源于Bacillus smithii T4菊粉酶催化效率高,比酶活可达1283.9 IU/mg,而且耐热性能更好。 采用化学修饰法研究Bacillus smithii T7产耐热菊粉酶的酶活中心氨基酸组成:发现PMSF(苯甲基磺酰氟)、2,3-丁二酮、NAI(N-乙酰基咪唑)、IAA(碘代乙酸)、DTT(二硫苏糖醇)修饰对菊粉酶活力影响不大,说明丝氨酸、精氨酸、酪氨酸以及赖氨酸均不是酶催化反应所必需氨基酸,且酶活中心不存在二硫键;DEPC(焦碳酸二乙酯)和EDCI(碳二亚胺盐酸盐)修饰菊粉酶的结果表明:菊粉酶的催化活性中心存在一个组氨酸残基和一个谷氨酸(天冬氨酸)残基,且组氨酸残基参与了菊粉酶的底物结合过程,而谷氨酸(天冬氨酸)残基只参与催化水解过程,推测Bacillus smithii T7产耐热菊粉酶的催化机理是经典酸碱催化机制;利用NBS(N-溴代琥珀酰亚胺)修饰菊粉酶及Tsou's plot分析,发现菊粉酶中有两个色氨酸残基为酶活性必需基团,而且色氨酸修饰前后,菊粉酶耐热性的变化表明色氨酸构成的疏水环境可能对Bacillus smithii T7产菊粉酶的耐热性起重要作用。


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