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Fostriecin生物合成基因fosH的异源表达及功能定位

余佳  
【摘要】: 聚酮化合物(Polyketides, PKSs)是一类具有生物活性的天然产物,主要由土壤微生物如链霉菌和相关丝状菌合成,另外真菌和植物也是其重要来源。目前已知的聚酮化合物大约有10,000种,其中包括很多有医疗价值的产物,如:抗生素,抗真菌剂,抗寄生虫药物,抗肿瘤化合物,降胆固醇药物以及免疫抑制剂等。 Fostriecin(福司曲星)及其衍生物是一类很有价值的聚酮化合物,它们是由Ⅰ型聚酮合成酶(TypeⅠpolyketide synthase,Ⅰ型PKS)以及后修饰酶共同作用合成的。Fostriecin钠盐(CI-920)首先是在链霉菌pulveraceus(亚种fostreus)的发酵液中被提取分离的,它是一种结构新颖的磷酸酯化合物,体内实验证明其具有广谱的抗肿瘤活性,能够很好地抑制白血病L1210和P388型细胞,而这些抗肿瘤活性源于它能选择性地抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)和蛋白磷酸酶4(PP4)。由于这些特性,Fostriecin作为先导化合物引起了很多科学家的兴趣,特别是Fostriecin的生物合成,更是成为了目前的研究热点。 为了实现对Fostriecin的生物学改造,需尽量获得完整的Fostriecin生物合成基因簇,并研究其功能,才能有针对性地对其进行改造。目前Fostriecin生物合成的分子生物学背景已经基本清楚,2005年美国Kosan Biosciences公司的研究人员首次报道了Fostriecin的生物合成基因簇,但其中几个后修饰基因簇的功能还没有完全定位。因此目前需要做的是利用基因重组技术,在异源宿主菌(链霉菌和大肠杆菌)中设计表达PKS基因簇,构建新型化合物的基因工程高产菌株,获得单一组分的化合物以及提供化学后修饰靶点,从而为生产制备具有自主知识产权的稳定性强的新型Fostriecin衍生物提供技术基础。此外,我们还要对没有完全功能定位的后修饰基因簇进行功能定位以完善Fostriecin的生物合成机制。 本课题的研究目标是完成对Fostriecin生物合成基因fosH的功能定位。fosH是从链霉菌pulveraceus亚种fostreus ATCC 31906中获得的,位于基因fosG的下游,是Fostriecin后修饰基因簇中的一种。同源比对结果显示它与phoslactomycin生物合成基因簇中的PlmT5具有43%的同源性。对fosH的编码蛋白FosH进行氨基酸序列分析后发现它与细菌激酶有很高的相似度,包括在抗生素生物合成中起作用的那些酶。虽然已有人推测FosH;是一种磷酸激酶,但是依然没有确切的实验证据来支持这一推断。通过在fosH基因中插入新霉素(neo)抗性基因以使fosH活的尝试多次失败,因此,我们采用将目的基因异源表达的方法来对其进行功能定位。在基因osH内同一开放阅读框中,有两个相距120bp的起始密码子,因此我们设计了两对引物,PCR扩增得到DNA片段fosH1和fosH2,并利用传统的方法将fosH基因克隆至表达载体pET-28b,目标蛋白FosH1和FosH2以组氨酸标签蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,通过对表达条件的摸索,获得了很好的可溶性蛋白,采用镍离子亲和层吸柱和超滤装置纯化和浓缩目标蛋白,得到了较好的纯化结果。另外利用C18反相色谱柱制备高纯度的Fostriecin和DP-Fostriecin(去磷酸化Fostriecin,用作目标蛋白的底物),经质谱和核磁分析后,证实了两者结构的正确性。目标蛋白FosH1和FosH2的体外活性测试证实了它们的磷酸激酶活性。这些研究为fosH的基因功能定位提供了实验证据,完善了Fostriecin的生物合成机制,从而为新型Fostriecin类似物的生物合成提供了新的机遇。


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