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链霉菌催化芳香硝基还原及其关键酶的分离与克隆表达

谢波  
【摘要】: 芳香硝基化合物广泛应用于医药、农药、染料合成中,其结构稳定,水溶性差,毒性大,难降解,是公认的主要环境污染物。由于硝基化合物芳香环上取代基的吸电子特性,使硝基还原成为降解芳香硝基化合物的重要步骤之一,同时由芳香硝基化合物还原得到氨基产物是精细化工生产制备芳胺的主要途径。因此,对芳香硝基化合物的还原可以实现环境保护和资源利用的双重意义。目前,化学还原法是化学和工业领域芳香硝基还原的常用方法,但该方法条件苛刻、存在严重的环境污染问题。生物催化方法条件温和,环境友好,简单易行,是可能替代化学还原的高效绿色技术,但芳香硝基化合物的高毒性和低溶解性很大程度上限制了生物催化剂的利用率,因此筛选高效的微生物或酶成为解决这一难题的有效方法。本研究筛选获得两株具有高效芳香硝基还原活性的链霉菌及其中起关键作用的硝基还原酶,为芳香硝基还原提供了新的酶源,为其在化学工业及环境修复中的应用提供了理论指导和技术支持。 本论文的研究内容包括以下几个部分: (1)从土壤样品来源的放线菌库中筛选获得两株高效还原芳香硝基化合物的链霉菌(Streptomyces sp.)。基于形态观察、生理生化特性分析和16S rDNA的系统分类鉴定,确定筛选到的两株菌株属于放线菌链霉菌属,分别命名为Streptomyces mirabilis DUT001和Streptomyces resistomycificus DUT002;其16S rDNA的GenBank登陆号分别为EU071006和EU216596;菌株已送交中国微生物菌种保藏管理中心保藏,保藏编号为CGMCC No.2517和CGMCC No.2518; (2)确定了链霉菌还原芳香硝基化合物的特性。两株链霉菌的适宜生长条件为30℃,pH值范围为6.5-7.5;还原芳香硝基的最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母提取物;1%(w/v)的表面活性剂Triton X-100、海藻酸钙包埋及0.1 mM的氧化还原介体AQDS等可有效地提高菌株的芳香硝基还原能力;而有机溶剂不同程度地抑制链霉菌对芳香硝基的还原作用,抑制作用强弱依次为异丙醇乙腈丙酮甲醇≈乙醇DMSO;利用芳香硝基化合物进行缺陷型培养驯化7代的Streptomyces mirabilis DUT001和Streptomyces resistomycificus DUT002对4-硝基-1,8-萘酐的转化能力分别提高到未驯化的1.8倍和1.5倍;两株链霉菌的底物谱较广泛,包括芳香硝基化合物如多环芳香硝基化合物3-硝基-1,8-萘酐、4-硝基-1,8-萘酐、3-硝基邻苯二甲酰亚胺、4-硝基邻苯二甲酰亚胺,和二硝基化合物如间二硝基苯和对二硝基苯,转化率在70%-95%之间;两株链霉菌还具有大环刚性芳香酮取代芴酮不对称还原活性和偶氮染料化合物酸性红B和K-2BP的还原(脱色)作用; (3)链霉菌硝基还原酶的分离纯化及性质表征。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法从链霉菌中分离纯化到一种依赖NADH的硝基还原酶,纯化倍数为33.79倍,收率为32%, SDS-PAGE显示单体分子量约为37 kDa,N端20个氨基酸的序列为DINGGGATLPQLYLTPDVLT,与NCBI数据库的Blast比对结果显示纯化得到的硝基还原酶N端与其它已知硝基还原酶的N端同源性较低。纯化获得的硝基还原酶最佳反应温度为40℃,最适反应pH值为7.5。硝基还原酶的动力学数据显示,该酶的催化反应符合双底物反应中顺序机制的特点,且辅酶和硝基底物浓度不影响各自的Km值。四种特异性硝基还原酶抑制剂的抑制效果为甲萘醌双香豆素苯甲酸钠抗霉素A,均表现为竞争性抑制剂。1%的Triton X-100对硝基还原酶的活性有一定的促进作用;二价金属离子对硝基还原酶活性有促进作用,其顺序为Mg2+ Ca2+ Sr2+Mn2+; EDTA和EGTA则明显抑制硝基还原酶的活性; (4)链霉菌硝基还原酶的基因克隆及在无细胞蛋白表达系统和大肠杆菌中的表达。从筛选的链霉菌基因组中调取到硝基还原酶基因snr,氨基酸序列分析及三级结构模拟表明该酶与其它已知硝基还原酶的氨基酸序列同源性较低,且以同源二聚体的形式发挥作用;氨基酸序列系统进化分析结果表明,该酶属于大肠杆菌硝基还原酶NfsB族。将调取的硝基还原酶基因在无细胞蛋白表达系统进行体外表达和大肠杆菌细胞体内表达,均得到了有活性的重组蛋白。通过固定化金属螯合层析和凝胶过滤层析2步纯化得到纯度较高、依赖NADH的重组链霉菌硝基还原酶,SDS-PAGE的结果显示纯化后的酶为单一条带,蛋白分子量约为25 kDa。酶反应的最适pH为7.5,最佳温度为30℃。重组链霉菌硝基还原酶可以还原多环芳香硝基化合物包括4-硝基邻苯二甲酰亚胺、4-硝基-1,8-萘酐、3-硝基-1,8-萘酐、3-硝基邻苯二甲酰亚胺和两种二硝基芳香化合物(1,4-二硝基苯和1,3-二硝基苯)。 综上所述,本研究筛选获得两株土壤链霉菌、分离纯化出一种天然的链霉菌硝基还原酶、克隆得到一种链霉菌硝基还原酶基因及其重组蛋白,均表现出高效还原芳香硝基化合物的特性,其转化率在70-95%之间。本研究细致分析了菌体转化和硝基还原酶催化还原芳香硝基化合物的最适条件和影响因素,初步探索了硝基还原酶的作用机制。本研究为芳香硝基化合物还原提供了新的生物催化剂和酶源,为其在化学工业及环境修复中的应用提供了理论指导和技术支持。


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