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生物荧光标识用菁染料的研究

王丽  
【摘要】: 随着蛋白质组时代的来临,荧光检测技术结合高效液相(HPLC)或凝胶电泳技术的应用大大推动了蛋白质组学的进步。但生物检测的灵敏度仍有待于进一步提高。菁染料是目前最主要的蛋白质荧光标示剂之一,该类染料的主要问题在于容易发生光漂白和自聚集导致荧光淬灭。本论文主要针对吲哚类菁染料进行合成、性能以及蛋白质荧光标记的应用研究。 为了开发出蛋白质标记效果更好的菁染料,合成了系列水溶性三甲川菁染料,其中N-对羧苄基-N'-磺丁基-5’-磺酸基-三甲川-3H-吲哚菁染料(Ⅱe)标记牛血清白蛋白(BSA)的检测限为4.8×10-10 mol L-1,达到文献报道的较灵敏的荧光试剂的水平。同时应用高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两种分析技术研究染料结构对蛋白质标记的影响。结果表明,在染料的琥珀酰亚胺活性酯(NHS)一侧应为疏水的,而在染料另一侧引入磺酸基来提供必要的水溶性,这样的染料结构更有利于蛋白质标记反应。 由于近红外染料可以有效避开生物自荧光所造成的干扰,合成了四个水溶性不对称五甲川菁染料(647-680 nm),结构未见报道。光稳定性实验结果表明,在吲哚环N位引入刚性苯环结构或空间体积较大的磺丁基等基团,能够提高染料的光稳定性能。应用其中具有较好光稳定性的N-对羧苄基-N'-磺丁基-5,5'-磺酸基-五甲川-3H-吲哚菁染料(Ⅲj)标记BSA,最低检测限达到1.2×10-8mol L-1,可比商品化染料荧光素异硫氰酸酯(FITC)检测更低丰度的蛋白质,与紫外检测相比检测灵敏度可以提高近二个数量级。 针对近红外五甲川菁染料光稳定性差的问题,设计合成系列水溶性方酸菁染料,其中两个不对称染料结构未见报道。光稳定性实验结果表明,方酸菁染料的稳定性优于五甲川菁染料的稳定性,不同N位取代基染料光稳定性大小顺序依次为对羧苄基苄基乙基羧戊基,可见,在吲哚环N位引入体积大、具有刚性苯环结构的基团,能够阻止单重态氧的进攻,从而提高菁染料的光稳定性。而对于同是苯环结构的对羧苄基和苄基来说,苯环对位具有吸电性的羧基更有利于提高菁染料的光稳定性。 此外,针对菁染料易于聚集的问题,合成了新型多氟取代三甲川菁染料,同时优化了反应条件,提高中间体和目标产物的收率。通过与传统无氟菁染料对比,多个氟原子的引入提高了染料在水中的光稳定性,减弱了染料的自聚作用。


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