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神经干细胞三维培养及构建类神经组织的研究

戚艳丽  
【摘要】: 目前,神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)的体外培养主要采用悬浮培养和贴壁培养体系,然而这两种培养体系都存在无法模拟体内NSCs生长微环境的缺点。而三维的细胞培养体系能够为细胞提供良好的生长环境,促进细胞分泌细胞外基质,从而形成与体内组织相近的结构。因此,本研究采用三维培养体系来培养NSCs,并构建出类神经组织结构。 实验以大鼠海马脑组织来源的NSCs为种子细胞,选用天然生物材料-胶原水凝胶为支架材料。首先对胶原内呈三维生长的细胞与传统单层培养细胞及悬浮培养细胞的生长和代谢情况进行比较。进而采用先期使用增殖培养基、后期使用分化培养基的策略,使NSCs在胶原水凝胶内先增殖然后向神经细胞分化,形成相互连接的类神经网络。采用cck-8试剂盒(Cell counting kit-8)对所构建的三维网络内细胞的增殖情况进行检测;使用激光扫描共聚焦显微镜观察所构建的三维类网络结构内经死活染色和免疫荧光染色后的细胞生长和分化情况。最后,对三维灌注式培养NSCs进行了初步的研究。 实验结果显示,胶原内三维培养的NSCs增殖倍数最大,4 d内可达70倍,而普通悬浮培养和单层培养的扩增倍数分别为2.5倍和35倍。葡萄糖和乳酸代谢检测结果表明,胶原内细胞的葡萄糖比消耗速率最小,比消耗速率曲线最平缓,且乳酸的比生成速率也最小。细胞-胶原构建物体外培养42 d后,构建物内的细胞活率维持在82%左右,细胞在构建物内分布较均匀,而且能够分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。此外,层粘连蛋白(Laminin, LN)预处理胶原蛋白海绵支架内NSCs的接种率(55.8±1.21%)较单纯用培养基处理的支架内接种率(43.1±1.18%)有显著提高。最后,灌注式生物反应器培养条件下,NSCs在支架中呈团簇生长、分布均匀、且阳性表达Nestin;灌注式三维培养利于细胞营养物质的供应,能够使pH值维持在细胞正常的耐受范围。 由以上实验结果我们得出以下结论:胶原内的三维培养条件更加利于NSCs的增殖和代谢,而且本研究所获得的三维组织构建物在形态、细胞构成等方面均与神经组织相类似;经LN预处理的胶原蛋白海绵支架更利于NSCs的粘附,可提高细胞在支架上的接种率;灌注式生物反应器培养条件有助于NSCs在支架中均匀分布和增殖,保持NSCs的特性。


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