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PFOS对大鼠脑海马钙离子信号转导通路影响及机制研究

刘晓晖  
【摘要】: 全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS)是全氟类化合物家族中代表性物质之一,被广泛应用于生产生活领域。PFOS具有难降解性、远距离迁移性以及易在生物体体内富集并沿食物链传播的特性,对生物体和环境具有潜在的危害。在2009年5月,PFOS被正式列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》 脑海马是生物体进行学习和记忆的重要组织器官,也是很多外源性化合物影响神经系统功能,产生毒性作用的靶器官之一。钙离子信号转导通路,是参与神经系统功能的重要调节机制之一,主要参与神经细胞突触传递、递质释放、细胞构筑和生长、酶系统的激活和突触可塑性改变等过程,其与学习记忆的关系已引起广泛的重视。外源性化合物主要通过对钙离子信号转导通路信号分子的调节,对神经系统功能产生影响。PFOS的神经毒性及其机理研究,是揭示PFOS对神经系统的潜在危害,对此类化合物进行健康风险评价的重要内容。 本论文以钙离子信号转导途径为研究对象,阐明:①亚慢性PFOS染毒对大鼠海马组织的毒性作用;②胚胎期染毒PFOS与出生后染毒PFOS,对仔鼠海马组织的毒性影响及差别,并探讨其机制;③PFOS诱导海马细胞内源性钙库释放的机制。为此,本文以大鼠海马组织和原代培养的海马神经元为试验材料,应用实时荧光定量RT-PCR Western Blot等生化技术,研究了活体和离体水平上的PFOS染毒,对钙离子信号转导途径的影响。 研究内容和研究结果包括, (1)建立亚慢性PFOS染毒模型,通过饮水染毒,形成1.7、5.0和15.0 mg/L三个实验组,从钙离子信号转导途径,揭示PFOS对大鼠脑组织产生毒性作用的机制。实验结果表明,可以在大鼠大脑皮质中检测到一定浓度水平的PFOS,其浓度水平随着染毒剂量的升高而升高;PFOS染毒可以显著上调大鼠脑海马和大脑皮质中,钙离子信号转导通路的重要信号分子,钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡα, CaMKⅡα)和环腺苷酸环化酶反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的蛋白表达量;通过对其下游信号分子的验证发现,PFOS持续诱导核内转录因子-即早基因表达上调。结果提示,PFOS通过上调大鼠皮质和海马组织中钙离子信号转导途径的重要信号分子的表达,可能对神经系统功能产生影响。 (2)通过胚胎期以及出生后仔鼠染毒PFOS的方式,形成仔鼠胚胎期和出生后均不染毒(对照组)及胚胎期染毒、出生后染毒、胚胎期和出生后均染毒三种仔鼠染毒PFOS的方式,考察PFOS染毒方式对仔鼠的神经系统功能的影响,并揭示PFOS的神经毒性机制。结果发现,可以在仔鼠脑海马组织中检测到一定浓度水平的PFOS;胚胎期染毒及出生后继续通过母乳染毒PFOS的仔鼠海马组织中PFOS的浓度要显著高于出生后染毒PFOS的仔鼠海马组织中PFOS的浓度;同时,这两种方式染毒PFOS的仔鼠海马组织中钙离子信号转导通路中的重要信号分子,N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚型(N-methyl-d-aspartate receptor subtype-2B, NR2B)和钙调蛋白(calmodulin, CaM)的表达,随着仔鼠年龄的增长,均先升高后降低;CaMKⅡ, CREB的表达在脑发育的关键时期均上调,而随着年龄的增长,均不发生显著变化;以上结果提示,不同方式的PFOS染毒,可以影响钙离子信号转导途径重要功能性信号分子的级联反应。结果表明,PFOS染毒可以对仔鼠神经系统的发育产生影响;PFOS对海马组织中NR2B及下游级联反应信号分子的调控表明,PFOS通过对谷氨酸受体亚型NR2B表达的异常诱导,对钙离子信号转导通路产生影响,是PFOS产生发育神经毒性的机制之一。 (3)利用原代培养大鼠海马神经元,应用流式细胞仪技术,探讨PFOS染毒诱导海马神经元内源性钙库的具体机制,同时对全氟化合物的另一种代表性物质,全氟辛酸(perfluorooctanoate, PFOA)对内源性钙库调节的机制也进行了探讨。结果发现,可以在海马神经元内检测到一定浓度水平的PFOS和PFOA,其浓度水平受到细胞外钙离子的影响,而且PFOS的浓度水平明显高于PFOA;在细胞无外源性钙离子时,PFOS和PFOA均可以显著诱导海马神经元内钙离子浓度升高,结果提示PFOS和PFOA可以通过细胞内源性钙库对海马神经元内的钙离子进行调节;分别使用钙库通道特异性抑制剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)和dantrolene(Dan)后,在进行PFOS染毒的细胞内钙离子浓度明显低于PFOS单独染毒组,但是显著高于对照组(p0.01);虽然在加入抑制剂后,再进行PFOA染毒的海马神经元内钙离子浓度并没有显著高于对照组(p0.05),但是显著低于PFOA单独染毒组(p0.01)。实验结果表明,三磷酸肌醇受体(Inositol(1,4, 5)-trisphosphate receptors, IP3Rs)和兰嘧啶碱受体(ryanodine receptors, RyRs)通道,是PFOS和PFOA诱导海马神经元内源性钙库,向细胞质中释放钙离子的机制之一。 综上研究结果得出,PFOS通过诱导细胞膜上谷氨酸受体亚型NR2B开放,引发海马细胞外源性钙离子内流,同时诱导细胞内源性钙库上IP3Rs和RyRs通道开放,向细胞质中释放钙离子,导致神经元内钙离子浓度升高,对其下游信号分子CaM, CaMKⅡ, CREB,以及c-fos和c-jun的表达异常调节,从而对神经系统功能产生影响。


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