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产纤维素酶菌株选育、优化培养及酶纯化工艺研究

张欢  
【摘要】:本文对实验室6株产纤维素酶菌株进行酶活特性研究。首先通过观察纤维素平板的酶溶解透明圈大小进行初步分析,比较6株菌种子发酵液中纤维素酶含量。根据不同纤维素酶组分作用的底物化学键的不同,分别测定发酵培养后菌株的滤纸酶活力(FPA)、纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)活力、纤维素外切葡聚糖酶(CBH)活和β-葡萄糖苷酶(CB)酶活力,发现菌株中黑曲霉的各产酶指标均高于其它菌株,其中FPA可达到40.66U·mL~(-1)、CMCase酶活达到60.88U·mL~(-1)、CBH酶活为14.94U·mL~(-1)、CB酶活为65.08U·mL~(-1),并且一般在120~144h之间各协同酶活力达到最大值。将各发酵菌液产出的纤维素酶分别作用纤维素粉和秸秆粉,经酶解后发现,各菌株所产的纤维素酶均有降解天然纤维素的能力,其中黑曲霉产生的还原糖含量最高分别为0.56mg·mL~(-1)和0.26mg·mL~(-1) 在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken原理对黑曲霉产纤维素酶发酵工艺进行优化设计,得到最适碳源中稻草粉含量为9.47g·L~(-1)、麸皮含量49.33g·L~(-1),氮源中(NH4)2SO4含量为2.0g·L~(-1),发酵后黑曲霉产生的滤纸酶活力达到76.72U·mL~(-1),比优化前酶活力提高88.69%。采用优化后的发酵液酶解处理纤维素粉和稻草粉,并通过扫描电镜和红外光谱分析研究其表面结构及各成分的特征吸收峰。 对黑曲霉发酵液所产出的3种协同酶组分进行了分离纯化工作,研究结果表明,使用70%饱和度硫酸铵沉淀效果最佳,经Sephadex G~(-1)00分子筛凝胶过滤层析后其内切葡聚糖酶的比活力明显提高,回收率为18.09%、纯化倍数达到3.48,外切葡聚糖酶的回收率为12.97%、纯化倍数达到4.12,β-葡萄糖苷酶的回收率为22.38%、纯化倍数达到3.59。经SDS-PAGE电泳检测分析可知,外切葡聚糖酶已达电泳纯,其相对分子量为50.51KD。


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