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顺序注射化学发光联用技术选择性测定三种氨基酸的研究

高春英  
【摘要】:生命科学是21世纪最重要的科学研究领域,氨基酸分析在生命科学研究中占有重要的地位。建立准确、灵敏、简便、快捷的氨基酸分析方法对蛋白质化学、临床医学、生理研究、及食品分析有着重要意义。 化学发光法以其灵敏度高、分析速度快、简便和线性范围宽等诸多优点,促使人们做了大量的研究工作。它在生命科学、临床医学和环境科学等许多领域的应用都已成为研究的热点。流动注射分析技术可以精确地控制试剂和试样的体积以及混合时间,提高方法的重现性;易于控制采样操作、减少试剂和试样的消耗;自动化程度高,显著提高分析频率。顺序注射分析作为流动分析的一个分支或第二代流动注射分析在上世纪九十年代被提出来。它更新了仪器装置,简化了操作使其更易微机化,达到了自动化和智能化的新水平,可以用同一装置完成不同组分的检测而无需改变流路的设置,成为流动注射分析研究中最活跃的领域之一。流动注射和顺序注射及其混合体系已发展成为自动分析和在线样品处理技术的主要手段。流动分析进样和化学发光检测技术耦合,保留了化学发光检测技术固有的优点,克服了通常化学发光分析中因反应速度快,反应过程难以控制,重现性较差的弊病,进一步改善了后者的分析性能,显著地提高了分析结果重现性、准确度和分析速度。本文将顺序注射进样技术和化学发光检测方法联用,建立了简便、快速、灵敏、选择性测定氨基酸含量的分析方法,并讨论了部分化学发光反应体系的反应机理。 第一章简要评述了近年来应用于氨基酸分析的主要方法,包括色谱分离方法、化学计量学解析,各类光学检测方法和其它分析方法等。 第二章将顺序注射进样技术与化学发光检测技术联用,详细研究了顺序注射条件下特有的进样顺序对发光信号强度的影响。模拟实验结果表明,对于快速发光反应体系,因待测试样区带排序位置不同引起的试样分散程度不一是发光强度变化的主要因素。基于丁二酮肟存在下组氨酸能够增强Mn(Ⅱ)盐对鲁米诺与过氧化氢发光反应的催化能力,建立了顺序注射化学发光联用技术选择性测定组氨酸含量的新方法,线性响应范围为5.0×10-7~1.0×10-3 mol/L,检出限(3σ)为2×10-7mol/L,方法的相对标准偏差(R.S.D.)为0.97%(4.0×10-5mol/L,n=11)。在实际样品分析中,回收率在90.0~103.3%之间。 第三章研究了Ce(Ⅳ)-Tween20-Trp发光体系。在酸性介质中,色氨酸能够显著增强Ce(Ⅳ)和Tween20的发光反应。据此,建立了顺序注射化学发光联用技术测定色氨酸的新方法。线性分析范围为2.0×10-7~8.0×10-6mol/L,检出限为1.5×10-7 mol/L,方法的相对标准偏差为0.7%。与Ce(Ⅳ)-Trp直接发光反应相比较,本方法线性分析范围下降了一个数量级。该方法用于氨基酸注射液和啤酒中色氨含量的测定,结果满意。此外,本章通过研究相关反应物和反应产物的化学发光光谱、吸收光谱和荧光光谱,探讨了Ce(IV)-Tween20-Trp体系可能的发光反应机理。该反应的发光体为Tween20的中间氧化产物,在这个化学发光反应中,色氨酸是Ce(Ⅳ)与Tween20反应的增敏剂。 第四章研究了色氨酸和酪氨酸对Ce(IV)-quinine-Cys发光体系的抑制效应;提出了利用Ce(IV)-quinine-Cys-(Trp+Tyr)反应体系中色氨酸和酪氨酸的抑制效应和Ce(IV)-Tween40-Trp体系中色氨酸的增强效应,同时测定色氨酸和酪氨酸含量的化学发新方法;采用双泵双阀的顺序注射进样和空气微柱间隔发光信号,消除了顺序注射流路毗邻信号间的干扰,成功实现了酪氨酸和色氨酸同时检测。通过色氨酸和酪氨酸对Ce(IV)-quinine-Cys体系的抑制作用,得出二者总的含量;利用色氨酸对Ce(IV)-Tween40体系的增敏作用,测得色氨酸的含量,总量与色氨酸含量之差就是酪氨酸的含量。对于Ce(IV)-quinine-Cys-(Trp+Tyr)反应体系,测定范围为3×10-7~1.2×10-5 mol/L时,检出限为2.9×10-6 mol/L,方法的相对标准偏差为1.1%(n=9);对于Ce(IV)-Tween40-Trp发光体系,测定范围为2×10-7~1.4×10-5 mol/L,检出限为9.0×10-8 mol/L,连续9次测定色氨酸的相对标准偏差为1.3%。探讨了可能的反应机理,认为Ce(IV)-quinine-Cys-(Trp+Tyr)体系发光反应的发光体为奎宁;而Ce(IV)-Tween40-Trp体系发光反应的发光体可能为Tween40的中间氧化产物。用该方法实现了氨基酸注射液、啤酒、牛奶、豆浆和血清等样品中色氨酸和酪氨酸含量的测定,其中,牛奶和豆浆中色氨酸和酪氨酸测定结果与对照方法一致。该方法检测下限和检出限低,适于痕量色氨酸和酪氨酸的测定。 综上所述,本文建立了顺序注射与化学发光联用技术选择性测定几种氨基酸的分析方法,方法具有操作简单、试剂和样品的消耗量少、灵敏度高、分析速度快的特点。实现了食品和药品中相应氨基酸的含量测定,提高了顺序注射与化学发光联用技术检测氨基酸的应用能力。研究了相关反应可能的反应机理,为化学发光的机理研究提供了参考。


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