顺序注射微流控焦磷酸测序系统的改进及其应用

【摘要】：DNA序列测定技术是现代生命科学研究的核心技术之一。与传统Sanger法相比,焦磷酸测序技术是一种实时的DNA测序技术,具有快速、高效、成本低的特点。现有的焦磷酸测序系统的发展主要有两种趋向：一种是针对大规模测序的高通量系统,另一种是针对床边检测的便携式的系统。本文在已有研究的基础上对基于磁珠微反应器的微流控焦磷酸测序系统进行了改进,并初步用于甲型流感病毒H1N1MP基因的分型和单核苷酸多态性检测。 首先利用导磁片诱导永磁铁加磁的方法将表面固载化学反应基团的磁珠固定在毛细管内形成流动微反应器,通过周期性改变毛细管与导磁片之间的距离的方法使磁珠在反应器中进行强制搅拌运动,使流动液固反应的效率得到有效改进。此流动微反应器的制作方法简单,不涉及任何微加工。通过改变磁场很容易进行磁珠的固定、搅拌及更换操作,微反应器可以实现重复利用,与顺序注射相结合成为通用性好的微流控流动分析平台。 其次,基于如上方法制作的流动微反应器,以注射泵为动力,微弱化学发光仪做为检测器,结合缝管阵列方法顺序引入试剂,建立了微型流动焦磷酸测序系统。通过向三酶系统的反应液中力加入apyrase(?)勺方法使背景信号大大降低。利用所建立的系统对反应条件进行了系统研究,成功测定了人工合成DNA单链的28个碱基序列,并用于甲型流感病毒H1N1MP基因的序列测定和SNP位点的检测,取得了与液相静态焦磷酸测序方法一致的结果。 此微流控焦磷酸测序系统搭建及控制方法简单、价格低廉、不需要微加工技术、易于实现自动化和便携化,特别是在克服传统焦磷酸测序方法的测序长度限制有很大潜力。