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低温等离子体介质阻挡放电技术对几种海洋多糖降解的研究

衣萌  
【摘要】:与多糖相比,寡糖在分子结构和生理功能方面具有明显的优势,但是寡糖在自然界中又难于获取,因此研究如何高效地将多糖降解为结构明确、品质可控、回收率高的寡糖成为实际应用的关键技术。本研究采用低温等离子体介质阻挡放电技术降解肝素、鲍鱼多糖、刺参多糖,结果发现,不同的输入电压、降解时间、初始浓度、电极间距和溶液种类等因素对多糖的降解率有必然的影响。低温等离子体技术应用电力能源,不引入化学助剂,可以采用水为多糖降解介质,安全无污染,低碳环保,其产品成本低廉,具有市场竞争力,可以解决目前多糖产品品质不易控制、药物活性不稳定等多种不良因素,为多糖的降解奠定了基础,具有广阔的应用发展前景。利用酶解法与碱提法相结合的方式提取鲍鱼腹足多糖、刺参体壁多糖,经Sepharose CL-6B凝胶柱层析进行分离纯化。优化输入电压、降解时间、初始浓度、电极间距和溶剂种类等因素,确定降解反应的最优条件。对降解过程的降解率变化、硫酸基含量变化进行监测,并对降解产物的分子量、pH变化、结构、抗凝血活性、抗肿瘤活性进行测定。对肝素的降解研究发现,当输入电压由60 V变化到90 V时,降解率逐步增加,降解产物的分子量逐渐减小,pH由中性变为酸性,硫酸基含量逐渐。当降解时间延长时,降解率逐步增加,硫酸多糖含量逐渐降低。当初始浓度由1mg/mL增加到7mg/mL时,降解率呈现先降低后增加的趋势。随着电极间距的增大,降解率逐渐降低。综合以上可选择输入电压70V、降解时间7min,电极极间距12mm、初始浓度7mg/mL为最优降解条件。选取最优条件下得到的降解产物进行红外光谱分析,与原样对比,降解产物的多糖特征吸收峰未发生改变,肝素的主体结构未被改变,-OSO3-基团的S=O伸缩振动减弱,表明硫酸基含量降低,但只要控制一定的降解条件,其含量是可控的。降解产物经过1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3methyl-5-pyrazolone,PMP)衍生化,然后应用HPLC-MSn分析共发现1种单糖、6种寡糖。降解产物经超滤得到不同分子量区间的低聚寡糖(分子量区间分别为1~3kDa、3~10kDa、10kDa),测定血浆凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)、活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplin Time,APTT)和血浆凝血酶时间(Thrombin Time,TT)的变化情况来判定其抗凝血活性的大小,结果表明,肝素经降解后得到的不同分子量区间的寡糖产物仍具有较好的抗凝血活性;同一分子量区间的产物其抗凝血活性随着浓度的增加而不断增大。与分子量为1~3 kDa、3~10 kDa的降解产物相比,分子量10 kDa的降解产物硫酸基含量较高,在相同的浓度下其抗凝血活性较强,说明硫酸基含量与抗凝血活性呈现正相关。利用酶解法与碱提法相结合的方式从鲍鱼腹足、刺参体壁中提取粗多糖,经SepharoseCL-6B凝胶柱层析进行分离纯化,鲍鱼粗多糖得到AP-1、AP-2、AP-3三个组分,测其总糖含量分别为68.32±0.84%、88.66±1.75%、84.80±0.63%,硫酸多糖含量分别为 14.93±0.18%、11.18±0.18%、11.80±0.35%。刺参多糖纯化后得到两个组分 SP-1、SP-2,其总糖含量分别为18.22±0.84%、38.22±0.56%,硫酸多糖含量分别为53.68±0.18%、24.43±0.88%。对影响鲍鱼多糖组分(AP-2)、刺参多糖组分(SP-2)降解效果的输入电压及降解时间因素进行了研究。对于AP-2,当输入电压由60 V增加到90 V时,降解率增加了 1倍;当处理时间由1 min延长到7 min时,虽然其降解率数值很小,但其数值变化值同样增加1倍,说明时间的延长同样会促进多糖的降解。对于SP-2,当输入电压由60 V增加到90 V、降解时间由3min延长到9min时,降解率由60%逐渐增加到80%,可能是由于可被降解的大分子物质较少,在较低电压及较短时间内可被降解,降解率没有明显增加。应用MTT法测定10-500μg/mL浓度范围内多糖及寡糖产物抗肿瘤(肝癌细胞HepG2)活性,结果发现AP-2降解产物浓度为50μg/mL时,对癌细胞的生长有抑制作用,继续增大浓度,没有明显的抑制作用;SP-2及其降解产物没有明显的抗肿瘤活性。本实验优化了影响降解的条件:输入电压、降解时间、溶液初始浓度、电极间距,结果发现,随着输入电压的增大、降解时间的延长、电极间距的减小,降解率呈现逐渐增加的趋势,随着溶液初始浓度的增大,降解率呈现先减小后增加的趋势,结果表明低温等离子体介质阻挡放电技术可被应用于多糖的降解中,为多糖降解奠定了一定的基础,在实际应用中有较好的发展前景。


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