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嘧肽霉素结构测定及作用机理研究

穆凌霄  
【摘要】:嘧肽霉素是我校自主研发的生物农药,具有高效、低毒、低残留等优点,可以防治多种农作物病毒病害和真菌病害,已获得国家发明专利。本文以生物活性为检测手段,利用多种色谱方法获得了嘧肽霉素中两种抗真菌物质的纯品组分1和组分2,一种抗细菌物质的纯品组分3,和一种抗病毒物质的粗品组分4;通过波谱法对组分1和组分2进行了结构解析;开发了组分1和组分3的高效液相色谱分析方法;研究了组分1的抗真菌机理和组分3的抗病毒机理,结果如下: 1.组分1以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为指示菌分离而得。嘧肽霉素发酵液经离心得上清,草酸酸化预处理充分去除蛋白质等杂质,依次经过大孔吸附树脂Diaion HP20吸附,50%甲醇洗脱;TOSOH SP650M离子交换柱吸附,0-1mol/L NaCl梯度洗脱;Daisogel ODS-B反相柱纯化,20%甲醇作为流动相,冻干得纯品。经紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振试验最终得到了组分1的分子式为C12H13N5O4,并推测了其结构式。这是首次获得嘧肽霉素抗真菌组分的纯品和结构式。 2.组分2同样以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为分离指示菌,经过大孔吸附树脂吸附后的活性馏分用硅胶柱层析进行进一步分离,氯仿:正丁醇:甲醇:醋酸=42:2:4:2作为流动相,并用Sephadex LH-20以20%甲醇作为流动相做最后的纯化,可得到纯品。质谱检测表明组分2的分子量是244。质谱、核磁、紫外等多种试验结果表明组分2可能是组分1合成过程的中间体,也可能是组分1由于发酵时间过度或其它原因发生降解的产物。 3.组分3以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus. Frankland)作为指示菌分离得到。预处理后的发酵液先后经过大孔吸附树脂Diaion HP20和离子交换树脂SK1B去除杂质后,用732阳离子交换树脂配合0.1-0.5 mol/L氨水梯度洗脱进行浓缩分离,最后依次通过HW40和LH-20分子筛层析柱纯化,得到分子量为574的纯品。 4.组分4具有抗TMV活性,通过枯斑抑制试验分离。嘧肽霉素发酵液通过大孔吸附树脂吸附,用50%丙酮洗脱并浓缩蒸干之后用ODS-BP反相柱分离,0-100%甲醇梯度洗脱,得到组分4粗品。 5.开发了嘧肽霉素组分1的高效液相色谱定性和定量分析方法,最佳色谱条件为:色谱柱选用DIKMA DiamonsilⅡC18柱(200mm×4.6mm,φ5μm);检测波长为278nm;流动相为20%甲醇水溶液,柱温为30℃。此色谱条件下组分1保留时间约10.2min,此方法的准确度和精密度较高,通过此方法测得的嘧肽霉素发酵液中抗真菌组分含量为4.11μg/mL。组分2的性质与组分1相近,可以采用同样的分离条件进行分离。 6.明确了组分3的色谱分离条件:色谱柱选用DIKMA DiamonsilⅡC18柱(200mm×4.6mm,Φ5μm检测波长为230nm;流动相采用30mmol/L磷酸盐缓冲液,含有10mmol/L辛烷磺酸钠,pH=3。柱温为30℃。此方法可以进一步验证用于定性和定量分析。 7.抗菌谱测试表明组分1对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)等16种植物病原真菌有抑菌效果。组分1的抑菌防病机理研究表明:组分1能够显著抑制赤星病菌菌丝生长和孢子萌发,并导致菌丝和孢子萌发后的芽管明显畸形,但杀菌作用很弱或基本无杀菌效果。组分1能导致菌丝体内电解质泄漏,细胞膜上麦角固醇的含量降低,菌丝内和培养液中脂质过氧化产物—丙二醛的含量升高,证明其对病菌细胞膜有一定破坏作用。与此同时,组分1还可显著抑制菌丝体内可溶性蛋白的含量。 8.在嘧肽霉素各组分针对烟草花叶病毒的防效试验中,组分4在心叶烟上对TMV的防治效果最好,枯斑抑制率达100%,组分3次之,枯斑抑制率为74.9%,而组分1和组分2没有明显的防治效果。当测试四种组分对普通烟的治疗效果时,组分4的治疗效果最好,防效达到62.8%,组分3次之,为49.8%。组分1也表现出一定的防治效果,防效为18.3%。组分2对TMV在系统寄主普通烟NC89上没有治疗作用。 抗病毒机理研究表明,嘧肽霉素组分可以在体外直接作用于病毒粒子,使其丧失侵染能力,从而保护心叶烟免受TMV的侵染。生物学方法、紫外分光光度计法以及ELISA测定结果均表明,嘧肽霉素组分3处理后烟草植株体内的病毒浓度均显著降低,这说明组分3能够降低植株体内的病毒浓度,充分说明嘧肽霉素对病毒的复制和增殖有较强的抑制作用。应用实时荧光定量PCR技术对TMV RNA在烟草中蓄积量测定结果表明组分3可以在TMV侵入寄主早期抑制其基因组RNA的复制。


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