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软枣猕猴桃黄酮类化合物的提取纯化及生物活性研究

王菲  
【摘要】:东北野生软枣猕猴桃是人类宝贵的野果资源,软枣猕猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc)又名软枣子、猕猴梨、藤瓜和藤枣,为猕猴桃科猕猴桃属,多年生落叶藤本植物。分布于东北、华北、山东、西北及长江流域,其中东北南部山区较多见。根、茎、叶及果实均可以入药。根味淡、微涩、有健胃、清热、利湿等功能,茎可以做手杖及烟袋杆,其果实多汁,营养丰富,酸甜适口,风味独特。软枣猕猴桃中富含Vc和实用纤维素,果实中还含有糖类、黄酮类、维生素、氨基酸、矿质元素等功能活性成分,具有滋补强身、生津润肺等作用,对高血压、心绞痛、高血脂等症有一定的疗效。黄酮类化合物是一类植物中分布很广且重要的多酚类天然产物,具有广泛的生物活性和药理活性,对其进行深入研究,有利于保护野果资源,为东北野生软枣猕猴桃的综合开发利用奠定理论基础,具有重要的科研价值。 目前,国内外仅对软枣猕猴桃黄酮类化合物的初步提纯、组成及加工应用进行了研究,但对于东北野生软枣猕猴桃黄酮类化合物的制备、组成及生物活性研究未见报道。本文对东北野生软枣猕猴桃黄酮类化合物的提取纯化、结构鉴定以及生物活性进行了系统研究,主要研究结论如下: 1、选用ZrOCl2比色法、AICl3比色法、NaNO2-Al(NO3)3比色法以及HPLC法等四种测定方法对软枣猕猴桃总黄酮含量进行测定,通过对总黄酮粗提液和芦丁标准品与不同显色剂反应后进行200-600nm波长扫描,根据扫描结果确定各种反应的适合检测波长并进行定量分析比较。结果发现,AlCl3比色法和NaNO2-Al(NO3)3比色法测定结果不准确、误差极大,而ZrOCl2比色法测定结果与HPLC法接近。在284nm下,ZrOCl2比色法的线性回归方程是Y284=0.0114X一0.0001,R2=0.9991,平均加样回收率为99.4%,RSD=1.61%(n=5)。以芦丁为标准品的ZrOCl2比色法是一种操作简便、结果较准确的方法,适用于软枣猕猴桃总黄酮含量的测定。 2、通过单因素和响应曲面法试验比较了超声波辅助提取法和微波辅助提取法的提取效果,最终确定选用超声波辅助法对软枣猕猴桃黄酮类化合物进行提取,其最佳工艺条件是:乙醇溶液浓度70%、料液比1:4(g/mL)、超声功率270W、超声时间6min、水浴温度60℃、水浴时间40min,提取2次,在此条件下,实际得率为0.297mg/g(湿重)。 3、在试验所选用的九种大孔吸附树脂中,通过对影响大孔树脂吸附与解吸性能的各种因素的研究表明,HPD-600对软枣猕猴桃黄酮类化合物的吸附量大,易解析,产品纯度高,对软枣猕猴桃黄酮类化合物具有较好的吸附分离性能,适用于对软枣猕猴桃黄酮化合物的纯化。经过试验确定最佳工艺条件为:上样液质量浓度为0.5mg/mL,上样液pH值为4-5,吸附流速为2mL/min,上样量为3BV,以3BV的水冲洗树脂柱,4BV的80%乙醇溶液以2mL/min的解吸流速洗脱。经处理后的软枣猕猴桃总黄酮平均回收率可达86.5%,平均纯度为37.2%。经大孔树脂处理的软枣猕猴桃黄酮类化合物再经聚酰胺柱层析进一步分离纯化,通过梯度洗脱得到了良好的分离效果,在所使用的20个梯度中产物主要集中在水:甲醇=6:4和水:甲醇=0:10中;收集这两个梯度的洗脱液,减压浓缩、冷冻干燥后,得到棕黄色粉末,以备制备使用。 4、将聚酰胺梯度洗脱所得产物使用反相高效液相色谱(RF-HPLC)半制备型液相色谱分离制备软枣猕猴桃黄酮类化合物纯品。将经聚酰胺柱层析分离得到的软枣猕猴桃总黄酮干粉用甲醇溶解成30mg/mL的溶液,经0.45 u m微孔滤膜过滤后进样。水:甲醇=6:4收集物的制备液相色谱的分离条件为:流动相水:甲醇=55:45(V/V),流速5.0mL/min,上样量400μL,柱温为30℃,检测波长为340nm。水:甲醇=0:10收集物的制备液相色谱的分离条件为:流动相水:甲醇=20:80(V/V),流速5.0mL/min,上样量600 u L,柱温为30℃,检测波长为340nm。此条件下能达到良好分离,分离时间约为60min。主要接收到五个流分,产品纯度可达99%以上。 5、通过核磁共振和薄层层析法鉴定了软枣猕猴桃的三个黄酮组分,即:异槲皮苷、槲皮素和芦丁。其中,异槲皮苷是在软枣猕猴桃种中是首次被发现。 6、采用分光光度法,通过与Vc对比,研究软枣猕猴桃黄酮类化合物的体外抗氧化作用,结果表明,软枣猕猴桃黄酮类化合物具有很好的对DPPH自由基的清除作用和抗脂质体过氧化作用,ICso分别为16.09μg/mL和0.46mg/mL,并且优于Vc;对Fe3+具有较好的还原作用,是Vc的0.86倍;对超氧阴离子自由基和羟基自由基有一定的清除作用,ICso分别为7.33mg/mL和9.16mg/mL,差于Vc。抗氧化作用与软枣猕猴桃总黄酮含量呈正相关,软枣猕猴桃总黄酮具有显著的抗氧化活性。 7、软枣猕猴桃黄酮类化合物对细菌和酵母菌的生长均表现出一定的、较为广谱的抑制作用,但对霉菌生长的抑制作用不明显。说明软枣猕猴桃黄酮类化合物的有一定的抑菌作用。


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