盐土多环芳烃降解菌筛选分离及其污染修复应用基础研究

【摘要】：我国陆上许多油田位于盐碱土地区,随着石油工业的发展,油田周边土壤受到多环芳烃(PAHs)污染越来越严重；此外,最近频发的海上石油泄漏事故也使滨海地区盐土PAHs污染事件常有发生。为此,盐碱土壤PAHs污染问题已越来越受到人们的关注。微生物降解被认为是去除环境中PAHs的主要途径,但盐碱土壤苛刻的生境条件和芳香族化合物危害的双重胁迫,使普通微生物难于在其中存活生长,致使盐碱土壤微生物修复PAHs污染变得困难。本文从长期受石油污染的天津大港油田滨海盐土中筛选分离出耐盐碱PAHs高效降解菌,采用液体培养的方法,系统研究了不同盐分含量、酸碱度以及PAHs浓度等生境条件,对菌株降解PAHs的影响；并以大港油田盐土为供试土壤,采用人工室内模拟的方法,对高效菌株固定化、以及向污染土壤添加表面活性剂等生物强化方式降解PAHs进行了系统的研究；在此基础上,通过测定细菌Pantoea sp.TJB5降解PAHs酶活性及降解酶相关基因的表达,从酶学和分子水平上阐释了细菌Pantoea sp.TJB5对PAHs降解机制。结果表明,菌株具有较强降解PAHs的能力,用于盐土PAHs修复是可行的。所得主要研究结果如下。 1.以菲、芘混合样品为唯一碳源和能源,在滨海盐土中分离出5株细菌、3株真菌。效率测定结果表明,分离出的8个菌株均能降解PAHs,但降解能力不同。分离出的5株细菌分别编号为TJB1、TJB2、TJB3、TJB4和TJB5,3株真菌编号为TJF1、TJF2、TJF3。TJB1为叶杆菌属(Phyllobacterium sp.)、TJB2和TJB3为假单胞菌属(Pseudomonassp.)、TJB4为盐单胞属(Halomonas sp.), TJB5为泛菌属(Pantoea sp.); TJF1为青霉属(Penicillium sp.), TJF2为双曲孢属(Sigmoidea sp.), TJF3为胶孢炭疽属(Colletotrichum sp.)。 2.选取降解能力较强的细菌Pantoea sp.TJB5、真菌Penicillium sp.TJF1和8株菌混合液(TJM)为供试菌株进行液体培养,以典型PAHs—菲和芘为研究对象,系统分析了pH、盐分含量、PAHs初始浓度以及葡萄糖供应水平对供试菌株降解PAHs效率的影响。结果表明,随着PAHs初始浓度增加,供试菌株对PAHs的降解效率逐渐降低,但以Pantoea sp.TJB5对菲、TJM对芘的降解效果较好；Pantoea sp.TJB5、Penicillium sp.TJF1和TJM具有很强的耐盐碱特性,在菲、芘初始浓度均为50 mg/L、盐浓度2%、pH 8.6的液体条件下,它们对菲、芘的降解率分别达到93.9%、41.3%、56.6%和20.1%、27.9%、52%；加入适量葡萄糖作为共代谢底物可促进对PAHs的降解,其中Pantoea sp.TJB5、Penicillium sp.TJF1和JTM对菲、芘降解率分别提高了1.2%、5.5%和22.5%、29.3%及35.5%、13.8%。 3.对Pantoea sp.TJB5降解PAHs功能酶进行定位测定,结果表明该酶为胞内酶。红外图谱分析结果表明,胞内酶含有—OH、—NH、C=O、C—O、C=S等基团,属于某些酶蛋白质和糖类的基团,在对PAHs羟基化,脱羧等开环反应中发挥着一定作用,使PAHs水溶性增强,易被生物所降解。邻苯二酚-2,3-双加氧酶(C230)是PAHs开环裂解关键胞内酶,并从降解菌Pantoea sp.TJB5中扩增得到C230的部分基因序列,克隆测序获得534 bp,证明了PAHs降解过程中C230关键酶的存在。 4.降解菌Pantoea sp.TJB5、Penicillium sp.TJF1和菌群TJM在固定化、添加表面活性剂等处理条件下对菲和芘污染的盐土修复效果明显；实验结果表明对微生物做固定化处理和向污染土壤中添加表面活性剂,供试菌株对盐土中的菲、芘污染物具有较高的去除率,证明这在污染盐土的修复技术上是可行的。供试菌株固定化和添加表面活性剂处理50天对芘的降解率均较添加游离菌的对照处理高出20%以上；其中,固定化处理的混合菌效果最好,20天时盐土中的菲接近背景值,50天芘的去除率达到97.4%、高出对照处理游离菌的25.8%。 5.固定化菌株和固定化与鼠李糖脂联合处理修复盐土PAHs污染效果显著；添加固定化菌株和鼠李糖脂5个月后,土壤中4环PAHs的去除率为94.9%,高于游离菌处理。