珊瑚菜耐盐生理机制及液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

【摘要】：土壤盐碱化是人类面临的重要环境问题，它对农牧业的可持续发展构成了严重威胁。了解植物耐盐机制和培育具有一定经济价值的耐盐作物资源，对扼制土地的盐渍化和提高盐荒地的利用具有重要意义。 本研究在解除珊瑚菜种子休眠的基础上，针对种子萌发期和幼苗生长期建立了珊瑚菜耐盐性评价体系，并对其耐盐能力进行了鉴定；明确了珊瑚菜耐盐的类型和对盐胁迫的生理响应机制；获得了珊瑚菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因，并分析了其生物学特性。为进一步完善植物耐盐机制，开发和利用耐盐植物资源奠定了前期工作基础。主要研究成果如下： 1.珊瑚菜种子具有较强的休眠特性。在变温层积条件下，100mg·L~(-1)6-BA溶液可显著促进北沙参种子萌发，在第90d时发芽率达到最高为63.3%。离体萌发试验表明，胚乳因素对珊瑚菜种子萌发具有显著抑制作用，保留1/3胚乳的珊瑚菜种子萌发率最高，可以达到31%。而TDZ、6-BA和GA3处理不仅对解除珊瑚菜种子休眠的作用不大，同时容易导致出现畸形苗。 2.珊瑚菜种子萌发阶段具有较好的耐盐特性。NaCl溶液处理的半致死浓度为0.68%，致死浓度在为1.52%。当NaCl浓度大于1.5%时则显著抑制其种子的萌发。NaCl处理可以延迟种子发芽的初始时间，降低种子总发芽率。复水试验表明，珊瑚菜种子仍保持着较高的萌发潜力，萌发潜力与处理浓度呈显著正相关。 3.珊瑚菜幼苗生长期具有较强的耐盐特性。溶液培养条件下，100mmol·L~(-1)NaCl处理的珊瑚菜幼苗生长状态和生长量正常。当溶液中NaCl浓度超过200mmol·L~(-1)时生长开始受到抑制，在300mmol·L~(-1)NaCl处理条件下开始出现植株死亡，存活率为50%左右。 4.珊瑚菜幼苗生长期的相关生理指标表明，当珊瑚菜受到较低浓度（100mmol·L~(-1)）NaCl处理时，可溶性糖作为渗透调节物质首先发挥主要调节作用。随着盐浓度和处理时间的增加，抗氧化酶系统也逐渐启动。当NaCI浓度超过植物自身调节能力时，植物的单位反应中心数量会明显降低，从而影响植物的生长。经过多元统计分析表明，丙二醛含量、Fv/Fm、ETo/ABS、叶绿素a含量、DIo/RC和RC/CSo共同构成了珊瑚菜耐盐性指标的有效评价体系。 5.土壤盆栽条件下，随着NaCl处理浓度的增加，珊瑚菜生长状况变化明显。0.5%和1.0%NaCl处理浓度时，珊瑚菜受到轻微影响，当土壤NaCl浓度达到1.5%时，干物质积累率下降明显，个别植株死亡。 6.珊瑚菜不同器官中Na~+、K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)含量的测定结果表明，叶柄是珊瑚菜贮存Na~+的主要器官；正常条件下，叶柄中Na~+含量分别是叶片和根中的2.7倍和79倍。与Na~+不同，根中的K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)含量受NaCl处理的影响较小，含量均较稳定，与对照相比均不存在显著性差异；叶柄和叶片中的K~+随着NaCl处理浓度的增加呈降低趋势，Ca~(2+)含量则正相反，呈升高趋势；叶柄中Mg~(2+)也随着NaCl处理浓度的增加而降低，叶片中Mg~(2+)含量则变化不大；Na~+/K~+离子比在1.5%NaCl处理条件下，增加幅度较大，与其他处理相比存在极显著差异。 7. NaCl处理对珊瑚菜K~+、Na~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)离子选择性吸收和运输的结果表明，NaCl处理过程中，由土壤选择吸收K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)的能力均呈先升高后降低趋势；由根向叶柄选择运输中，三种离子均不断增加；由叶柄向叶片选择运输中，K~+和Mg~(2+)降低幅度明显，而Ca~(2+)含量变化不大。 8.珊瑚菜的光合作用受NaCl影响较大，0.5-1.0%NaCl处理条件下，气孔限制值导致光合效率的降低，而在1.5%NaCl处理条件下，光合效率的降低主要受叶肉细胞本身光合活性降低的影响。底物氧化途径和电子传递途径均表现出适应盐渍环境的特性。 9.呼吸速率和呼吸途径的测定结果表明，在0-1.0%NaCl处理条件下，珊瑚菜呼吸速率较稳定；当NaCl处理浓度提高到1.5%时，珊瑚菜呼吸速率下降幅度明显；EMP+TCA是珊瑚菜的主要底物氧化途径，随着NaCl处理浓度的增加，两者所占比例增加明显，而PPP则相反，降低趋势明显；电子传递途径中以CP为主，NaCl处理对CP和AP途径的影响不大。 10.珊瑚菜NHX的cDNA全长为2553bp，5′非翻译区为531bp，3′非翻译区为361bp，开放阅读框为1662bp，编码554个氨基酸。将珊瑚菜NHX编码区1662bp核苷酸序列在GenBank中进行比对后发现，与番茄的同源性为96％，矮牵牛为95％；与葡萄、杨树、番薯等几种植物部分序列相比同源性在80％以上，可以证明从珊瑚菜中克隆的是NHX基因。氨基酸预测和同源性分析表明，珊瑚菜NHX有11个跨膜结构区域，珊瑚菜NHX与矮牵牛、菊苣、刺槐等植物液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白亲缘关系较近。