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软枣猕猴桃多糖的结构初探及抗氧化活性、免疫活性的研究

宣丽  
【摘要】:软枣猕猴桃Actinidia arguta (Sieb.et Zucc.) Planch. ex Miq.又名软枣子、猕猴梨、藤梨,是猕猴桃科、猕猴桃属多年生落叶藤本植物。软枣猕猴桃以其耐寒性而著称,果实很小,如枣般大,表皮光滑无毛,可直接食用,甜酸比适中,风味极佳。它富含多种营养成分,如高Vc含量(200-400mg/100g)、高活性的蛋白酶、种类齐全的微量元素、丰富的不饱和脂肪酸含量等。其果实、种子及根茎均可入药,是理想的绿色食品和食疗食品。 目前对软枣猕猴桃的生物活性研究主要集中在根和茎上,而对于果实生物活性的研究仅限于果汁或果实提取物,无法确定其中某一具体物质的生物活性。多糖是软枣猕猴桃中的主要成分之一,如能确定其相关生物活性,并通过科学的生产方法将它提取出来,制成软枣猕猴桃多糖的相关产品,或作为食品添加剂,广泛添加于各类食品中,从而提高食品的营养价值,那不仅对于软枣猕猴桃产业的发展有极大的带动作用,而且还可以产生巨大的经济效益和社会效益。 本研究以软枣猕猴桃鲜果为原料,对软枣猕猴桃多糖进行了提取、纯化,对其结构进行了初步鉴定,并对其体外抗氧化活性和体内免疫调节作用进行了详细的研究,为今后软枣猕猴桃多糖的开发利用奠定了理论基础。研究结果如下: (1)在水提工艺之前首先确定了软枣猕猴桃的除杂工艺:乙醇浓度80%,料液比1:2g:mL,温度20℃,时间60min,通过该工艺,可以在几乎不损失多糖的前提下最大程度的除去色素、还原糖等杂质;然后分别采用高温水浴法、低温摇床法、微波法提取软枣猕猴桃多糖,并通过正交试验优化提取工艺,得到三种提取方法的最佳工艺条件。高温水提工艺:料水比1:9g:mL,温度100℃,时间120min,多糖提取率为2.19%;低温水提工艺:料水比1:9g:mL,温度40℃,时间120min,多糖提取率为1.54%;微波提取工艺:料水比1:12g:mL,微波功率500W,微波处理时间10min,多糖提取率为1.41%。 (2)采用高温水提工艺提取得到的软枣猕猴桃多糖AAP-1的得率为2.9%,颜色为白色,不含酚羟基和还原糖,含有淀粉,其多糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量分别为71.3%、15.1%、2.51%;红外光谱分析可知AAP-1在400-4000cm-1范围具有糖类的特征吸收峰,但它不含有果胶多糖中的GalA在指纹区的特征吸收峰;单糖组成测定结果表明:它由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7种单糖组成,各单糖的摩尔百分含量依次为:1.85%、0.11%、0.37%、0.24%、94.72%、2.45%、0.26%,其中葡萄糖的摩尔百分含量很高,推测是由于含有淀粉的缘故。 (3)采用低温水提工艺提取得到的软枣猕猴桃多糖AAP-2的得率为1.8%,颜色为白色,不含酚羟基、还原糖和淀粉,其多糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量分别为32.7%、46.2%、3.14%;红外光谱分析可知AAP-2在400~4000cm-1范围具有糖类的特征吸收峰并且证明它为果胶多糖;单糖组成测定结果表明它也由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7种单糖组成,各单糖的摩尔百分含量依次为:14.35%、4.16%、1.84%、6.64%、9.89%、24.75%、38.37%,其中甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量较高。 (4)采用微波辅助工艺提取得到的软枣猕猴桃多糖AAP-3的得率为2.6%,颜色为白色,不含酚羟基、还原糖和淀粉,其多糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量分别为30.8%、59.3%、1.06%;红外光谱分析可知AAP-3在400-4000cm-1范围具有糖类的特征吸收峰,并且证明它也为果胶多糖;单糖组成测定结果表明它也由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7种单糖组成,各单糖的摩尔百分含量依次为:13.16%、5.05%、1.53%、16.05%、21.97%、18.89%、23.35%,其中甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的含量较高。 (5)体外抗氧化实验的结果表明:AAP-1具有一定的还原力,它清除DPPH自由基和羟基自由基的能力相对较强,清除超氧阴离子自由基的能力很弱;AAP-2的总还原力和清除DPPH自由基的能力略高于AAP-1,清除羟基自由基的能力显著高于AAP-1,清除超氧阴离子自由基的能力与AAP-1相近;AAP-3的总还原力、清除DPPH自由基和羟基自由基的能力显著高于AAP-2,但清除超氧阴离子自由基的能力依然很弱。 (6)软枣猕猴桃多糖AAP-3经过DEAE-52纤维素柱层析,分别用蒸馏水、0.1mol/LNaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/LNaCl洗脱得到四个组分,依次命名为AAP-3a、AAP-3b、AAP-3c、AAP-3d,四个组分的得率分别为13.8%、47.0%、24.4%、8.4%,总回收率为93.6%;这四个组分再经过SephadexG-100凝胶柱层析后,都是只得到一个洗脱峰且峰形比较对称。经检测,每个组分中均含有极微量的蛋白;将SephadexG-100凝胶层析柱纯化后的四个多糖组分再经过SephadexG-200凝胶柱层析,依然只得到一个洗脱峰且峰形对称,说明经离子交换柱分离得到的每一部分,在凝胶柱上不再分离。经检测,每个组分中均不含有蛋白质。 (7)软枣猕猴桃多糖四个纯化组分的抗氧化活性测定结果表明:软枣猕猴桃多糖纯品也具有清除DPPH自由基和羟基自由基的能力,但对超氧阴离子自由基的清除能力依然很弱;盐洗组分的抗氧化活性明显优于水洗组分;三个盐洗组分中AAP-3b的抗氧化活性最强,AAP-3d次之,AAP-3c最弱;AAP-3b为软枣猕猴桃多糖中主要的抗氧化活性组分。 (8)紫外光谱扫描结果表明:AAP-3a、AAP-3b、AAP-3c、AAP-3d均不含蛋白、多肽及核酸,但四个组分的峰型表现出极大的差异,最大吸收波长也略有不同,表明四个组分在构成上有显著差异。 (9)采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定AAP-3a、AAP-3b、AAP-3c、AAP-3d的单糖组成,结果表明四个组分在单糖组成上差异显著。AAP-3a和AAP-3b由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6种单糖组成;AAP-3c和AAP-3d由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖7种单糖组成。AAP-3a以葡萄糖为主,AAP-3b以甘露糖和半乳糖醛酸为主,AAP-3c以半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖为主,AAP-3d以甘露糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖为主。 (10)红外光谱扫描结果表明:AAP-3a为中性多糖,它以α-糖苷键为主,并含有一定量的β-糖苷键;AAP-3b为果胶多糖,它以p-糖苷键为主,并含有一定量的α-糖苷键;AAP-3c也为果胶多糖,其中p-糖苷键的数量多于α-糖苷键。 (11)采用高效凝胶渗透色谱测定AAP-3b和AAP-3c的分子量,结果表明AAP-3b和AAP-3c仍然不是单一组分,AAP-3b中主要组分的重均分子量(Mw)为7,298Da,AAP-3c中主要组分的重均分子量(Mw)为14,146Da。 (12)通过体内实验研究了AAP-3b的免疫活性,结果表明:软枣猕猴桃多糖AAP-3b高剂量组可以促进大鼠的生长,并显著提高大鼠的脾脏指数;AAP-3b中剂量组和高剂量组可以显著提高大鼠的胸腺指数、吞噬指数和ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞转化指数。确证了软枣猕猴桃多糖可以通过促进免疫器官生长、增强细胞免疫功能、增强单核巨噬细胞吞噬能力等方式来提高机体的免疫力,具有一定的免疫活性。


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