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番茄灰霉菌拮抗放线菌及抑菌活性物质研究

朱茂山  
【摘要】:放线菌是农业微生物的重要类群,其代谢产物是农用抗生素的重要来源。本文从土壤样品中筛选得到对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)具有高抑菌活性的拮抗放线S-091菌株,并对其进行了种类鉴定、抑菌活性评价、发酵条件、抑菌机制以及抑菌活性物质的分离、纯化及结构解析等研究。 从采自不同地区的33份土壤样品中分离得到了112个放线菌菌株,并从中筛选出1株对番茄灰霉菌具有强烈抑菌活性的S-091菌株,该菌株还对多种植物病原真菌均表现出强烈的拮抗活性。采用传统放线菌分类方法和分子生物学相结合的鉴定方法对S-091菌株进行了种类的鉴定。结果表明S-091菌株的菌丝表面光滑,孢子丝成螺旋卷曲形态,孢子为椭圆形,表面长有丰富的疣刺,结合菌株的形态、培养特征及生理生化指标及16srDNA遗传分析,鉴定S-091菌株为链霉菌属不吸水链霉菌武夷山变种(Streptomyces. ahygrocopicus var. wuyishan)。 采用单因子测定和正交试验方法对S-091菌株的发酵条件进行了筛选优化。结果表明:可溶性淀粉显著影响活性物质产量,花生饼粉次之,微量元素中KC1显著影响活性物质产量。最优培养基配方:以花生饼粉1%、可溶性淀粉4.5%、氯化钾0.4%、酵母粉0.2%及硝酸铵0.1%为最佳配比。最适宜发酵温度为32℃、摇床转速为140r·min-1,pH值7.0,空气量以250mL三角瓶装液100-125mL为最适。 采用显微观察方法研究了S-091菌株发酵液活性成分的粗提物对灰霉菌的抑菌机制。用S-091菌株发酵液粗提物分别处理灰霉菌菌丝和分生孢子3hr和0.5hr后,菌丝停止生长,孢子停止萌发,菌丝体的细胞和分生孢子的内溶物产生浓缩凝集现象,并被处理的幼嫩菌丝体细胞在生长点处出现畸形膨大,但未见细胞壁和细胞膜破损、内溶物外溢,电导率测定表明支持无电解质外渗结论。 对S-091菌株发酵液活性成分理化性质研究结果表明发酵液活性成分对可见光、紫外光及热等环境因子具有很好的稳定性,对pH5以下的酸性条件下活性不稳定。有机溶剂萃取试验表明发酵液活性成分不溶于乙酸乙酯等有机溶剂;草酸沉淀法、丙酮沉淀法处理发酵液后沉淀部分无活性。通过pH纸层析、捷克八溶剂系统和Betina溶剂系统纸层析及纸电泳试验初步确定活性成分为两种或多种组分的混合物,并且活性成分极性中等或偏大,其中一部分为弱碱性,一部分强碱性。 用大孔吸附树脂柱、硅胶柱层析等分离方法对发酵液的活性物质粗提物进行去杂分离后,再采用制备型高效液相色谱仪对样品纯化,获得了主要活性成分的纯化合物,种白色无定形粉末状物质。将获得的纯化合物进行质谱与核磁谱的测定及结构解析,确定该活性化合物分子量为695,分子式为C35H53NO13,化学名称为:(1S,3R,5R,7E,13E,15E,17E,19ES,21S,23R,24S,25R)-11-甲基-12-乙基-1,3,5,25-四羟基-21-((2R,3S,4S,5S,6R)-四氢-6-甲基-3,5-二羟基-4-氨基-2H-吡喃-2-烷氧基)-10,27-二嗯-9-氧代-二环[21.3.1]二十七-7,13,15,17,19-五烯-24-羧酸,确定该化合物四烯类大环内酯类活性物质。通过文献检索发现该化合物为Tetramycin A,Tetramycin A在农用抗生素研究方面未见文献报道。


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