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甜瓜醇脱氢酶基因家族成员鉴定、分类及表达调控

靳亚忠  
【摘要】:薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)以其甘甜清脆和浓郁的香味深受消费者喜爱,香气是成熟薄皮甜瓜的重要品质之一。在香气物质合成途径中,醇脱氢酶是关键酶之一,而且,该酶是多基因家族,除了参与香气物质合成外,在植物生长发育、逆境胁迫等诸多方面均起作用。随着甜瓜基因组测序完成,为研究甜瓜醇脱氢酶基因家族在甜瓜生长发育中的功能提供了便利。本研究利用甜瓜基因组网站进行了醇脱氢酶基因家族成员的检索,结果表明该家族主要包括乙醇脱氢酶(ADH)和肉桂醇脱氢酶(CAD)两类基因亚家族,对这两类基因家族进行了相关的生物信息学分析,克隆了3个关键基因;并以薄皮甜瓜“彩虹7”为试材,研究了ADH和CAD基因各成员在甜瓜不同组织器官和果实不同生长发育时期以及在采后果实成熟衰老进程中的表达模式,并探讨了ABA、 IAA和乙烯处理对两类基因各成员的表达调控,主要研究结果如下: 1.利用‘'alcohol dehydrogenase "和‘'cinnamyl alcohol dehydrogenase"为关键词,在甜瓜基因组网站进行检索,获得13个乙醇脱氢酶(ADHs)基因家族成员和5个肉桂醇脱氢酶(CADs)基因家族成员,生物信息学分析发现13个ADHs基因家族中包括12个ADH成员和1个甲醛脱氢酶(FDH)基因,分别命名为CmADHl-12和CmFDHl;把CADs基因家族成员分别命名为CmCAD1-5.序列对比发现甜瓜CmADH1、 CmADH3-11和CmCAD1-5氨基酸序列含有中链脱氢酶具有的特征序列:Zn1催化位点[GHE(X)2G(X)5G(X)2V], Zn2结合区域[GD(X)9,10C(X)2C(X)2C(X)7C],以及辅酶因子结合区[GXG(X)2G],推测这些基因属于中链醇脱氢酶;CmADH2是短链脱氢酶;而CmADH12具有长链特征序列NASD和AAAGGTG,可能属于长链ADH基因。 2.甜瓜ADHs和CADs基因家族系统发育和序列比对分析表明,植物ADH基因家族分为中链、短链和长链醇脱氢酶类,甜瓜ADHs基因家族成员分别隶属于这3类;植物CAD基因家族分为7类,甜瓜CADs基因家族成员分别隶属于其中的4类。13个ADH氨基酸序列同源性为4.8%~52.48%,中链CmADH1和其他中链CmADH序列同源性为30%-40%;短链CmADH1与其他物种短链ADH基因同源性达80.38%;长链CmADH12与其他物种ADH基因同源性达82.32%。甜瓜CmCAD1和CmCAD2归类于bonafide CADs,两者之间同源性为77.07%,而二者与其他CmCAD同源性低于50%;CmCAD3属于第七类(groupVII), CmCAD4和CmCAD5分别属于第五类(groupV)和第二类(groupll). CmCAD5和CmCAD3, CmCAD4之间同源性分别为58.52%和50.55%:CmCAD基因成员与其他物种中CAD基因序列同源性为77.05%-81.97%。根据CAD基因家族氨基酸序列中关键残基的分析,CmCAD4可能是假基因或只特定在愈伤组织中表达。 3.根据从甜瓜基因组获得的CmADH8, CmADH10和CmCAD2的核苷酸序列和ORF序列设计引物,利用PCR法克隆了这2个ADH基因和CmCAD2基因。其中CmADH8全长1671bp,ORF为1272bp,编码423个氨基酸;CmADH10全长1631bp,ORF为864bp,编码287个氨基酸;CmCAD2全长1160bp,ORF为1095bp,编码364个氨基酸。3个基因核苷酸序列与基因组中相应基因核苷酸序列同源性分别为94.92%、92.90%和97.75%。 4.甜瓜ADH基因家族成员在甜瓜生长发育过程中存在时空表达差异性。CmADH2. CmADH1o和CmFDH1在所有的营养组织都表达并在雄花花瓣中表达强烈;CmADH9和CmADH11在所有组织中均不表达;CmADH4只在根中微弱表达,CmADH5.CmADH6和CmADH7在所有组织中表达较弱;CmADH8在不同营养组织中表达有差异。ADH酶活性在不同组织中存在差异,雄花和雌花的酶活性最大,老叶中的最低。CmADH1. CmADH2.CmADH10和CmFDH1在不同生长发育期的果实中都表达,在果实生长的中后期表达强烈,与果实中ADH酶活性变化一致。CmADH8和CmADH12在20DAA之后的果实中表达较高,且变化稳定。这些结果暗示了ADH基因家族在甜瓜营养器官及果实生长发育过程中起着关键作用,且存在成员之间的功能差异。 5.甜瓜CAD基因家族成员在甜瓜生长发育过程中也存在时空表达差异。除了老叶外,CmCAD5在各种组织中都表达强烈,且在雄花花瓣中表达最高;CmC4D4在所有组织中均不表达;CmCAD1-3在嫩茎中有较高的表达。CAD酶活性在不同组织中也存在差异,表现为嫩茎根雌花和雄花嫩叶老叶。CmCAD1在1DAA以及20-33DAA期间的果实中表达较高;CmCAD3在不同时期的果实中表达较低;CmCAD2和CmCAD5在不同生长发育期的果实中都表达,且在20DAA的果实中表达强烈,与果实中ADH酶和CAD酶活性变化一致。这些结果暗示了CAD基因家族成员参与了甜瓜营养器官及果实生长发育,且存在成员之间的功能差异。 6.随着甜瓜果实的生长发育,果实感官品质各指标呈现差→良→差现象,与内源乙烯变化趋势一致;香气成分中丁醇、反-3,顺-6-壬二烯醇、苯甲醇、肉桂醇等物质含量先升高后降低;己醛、肉桂醛、苯甲醛、反-2,顺-6-壬二烯醛等物质逐渐降低,醇类和醛类物质种类和总含量随果实发育逐渐减少;而乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯甲酯、肉桂醇乙酸酯等酯类物质含量逐渐增加,随着内源乙烯高峰出现之后,酯类物质种类和含量达到最大,之后稍有降低。ADH和CAD酶活性的变化趋势与酯类物质变化相似。结合部分CmADH和CmCAD基因家族成员在果实发育后期强烈表达的特性,表明这些成员可能参与了果实香气物质的生成,可能以基因家族网络的形式发挥着作用。 7.采收30DAA的甜瓜果实,在常温下(23℃)贮藏12d。随着果实后熟衰老,CmADH1.CmADH2.CmADH8.CmADH12和CmFDH1表达逐渐降低,而CmADH10o的表达较高且保持稳定。CmADH3-6.CmADH9和CmADHll在果实后熟期间表达较弱或不表达。CmCADl的表达逐渐增强,而CmCAD2、CmCAD3和CmCAD5的表达水平较低,并逐渐减弱,而CmCAD4在整个贮藏期间都不表达。 8.用100μL/L的外源乙烯处理30DAA果实24h;100μL/L1-MCP处理12h后,立即用100μL/L的外源乙烯处理24h,果实常温下贮藏12天。乙烯处理强烈诱导了4个CmCAD成员的表达,并诱导了CmADH1-3, CmADH8, CmADH12和CmFDHl的表达。随着贮藏时间的推移,CmCAD1、 CmCAD2和CmCAD5表达逐渐减弱,CmCAD3的转录水平从第1天之后迅速降低,其后一直保持恒定的表达水平,直到贮藏结束,而CmCAD4在任何处理的果实都不表达;1-MCP处理抑制了乙烯对ADH基因和CAD基因成员的诱导作用。采后贮藏期果实中ADH和CAD酶活性先升高后降低,与内源乙烯变化一致;外源乙烯诱导了ADH酶和CAD酶活性的升高,但是酶活性变化趋势与两类基因成员的转录不完全一致。这两种基因家族各成员对乙烯表现出不同的应答模式。 9.利用外源100μM的ABA和IAA浸泡30DAA果实圆片,真空浸透2h后,发现ABA强烈诱导了CmADH1-4, CmADH1O和CmFAHl的表达。IAA处理强烈诱导了CmADH6、 CmADH9和CmADH12的表达,而其他的CmADHs基因对IAA不敏感,仅保持较低的转录水平。CmCAD1-3和CmCAD5基因表达受ABA的诱导;IAA处理仅强烈诱导了CmCADl和CmCAD5的表达,而CmCAD2-3基因对IAA不敏感。反应了这两类基因家族成员对ABA和IAA表现出不同的应答模式。


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