干旱胁迫条件下马铃薯耐旱基因表达及叶片蛋白质组学分析

【摘要】：马铃薯(Solanum　tuberosum L.)为全球第四大粮食作物,种植马铃薯的国家达到150多个。中国马铃薯的种植面积和总产量居世界之首,其主产区多分布在干旱或半干旱地区,然而马铃薯对水分的亏缺十分敏感。随着环境不断恶化,水资源日益短缺,干旱频繁发生,严重威胁着马铃薯生产。培育耐旱马铃薯新品种,提高作物本身对干旱的忍耐力是马铃薯高产稳产的首选措施。本研究以'晋薯2号'(抗旱性强)、'东农308'(抗旱性较强)和'费乌瑞它'(抗旱性差)3个马铃薯品种的脱毒试管苗为材料,用20%PEG-6000处理模拟干旱胁迫,研究了干旱胁迫对马铃薯叶片超微结构和生理指标的影响,为抗旱资源筛选提供有效的评价指标;利用RT-PCR技术克隆并分析抗旱相关的转录因子StABEB基因在水分逆境中的调控表达情况;利用双向电泳技术研究了干旱胁迫条件下马铃薯叶片蛋白质组变化,并利用实时定量PCR技术研究干旱差异表达蛋白基因的表达变化规律,试图从分子水平上揭示马铃薯抗旱机制,为提高作物抗旱性及抗旱品种选育提供理论依据。研究结果如下:1.叶绿体对干旱胁迫反应最为敏感且受损伤最重;线粒体稳定性高于叶绿体;茎部细胞超微结构损伤轻于叶肉细胞器超微结构;耐旱品种超微结构损伤轻于不耐旱品种。超微结构发生变化的同时,马铃薯植株各项生理指标也随之改变。3个耐旱性不同的马铃薯品种叶片的丙二醛(MDA)含量升高48.89%～243.27%,并且差异都达到极显著水平;过氧化物酶(POD)活性升高2.06%～32.98%,'费乌瑞它'和'晋薯2号'分别达到极显著和显著水平;叶片相对含水量、根活力均下降,·超氧化物歧化酶(SOD)活性和叶绿素含量变化趋势不一致。叶绿体损伤程度和丙二醛含量变化可以作为马铃薯抗旱材料筛选的有效指标。2.利用RT-PCR方法克隆的马铃薯StAREB基因,与NCBI网站上的马铃薯AREB基因序列的一致性达到了 99.71%。其编码的氨基酸序列中,包括3个保守的磷酸化位点(C1、C2、C3)、一个核定位信号区NLS(KVVE)和一个bZIP保守区。StAREB基因保守结构域氨基酸序列与拟南芥AtABF1、AtABF2、AtABF3、AtABF4、烟草NbZIP、大麦HvABI5、水稻OsABI5等存在较高的同源性。StAREB与番茄S1AREB存在较近的亲缘关系,其次是AtABF2、NtbZIP,而与大麦的HvABI5、水稻OsABI5、拟南芥AtABF1、AtABF3、AtABF4等其他bZIP类转录因子亲缘关系相对较远。StAREB基因受干旱(PEG-6000)、低温、高盐诱导表达。在干旱胁迫诱导条件下,马铃薯StAREB基因表达显著上调,并且在整个胁迫过程中基因表达维持较高水平。3.获得16个干旱诱导差异表达的蛋白点,1～14号蛋白为上调表达,分别为磷酸激酶、推定的卤酸脱卤酶、推定的热休克蛋白70、推定的热休克蛋白STI、推定的ATP合酶β亚基、推定的植物可溶性无机焦磷酸酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基、推定的热休克蛋白STI、推定的甘氨酸富集蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、叶绿体锰稳定蛋白质、推定的类似叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶B、推定的类似叶绿体50S核糖体蛋白L4、叶绿体核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶-B,D链;15和16号是下调表达,分别是推定的类似线粒体异柠檬酸摩脱氢酶[NAD]调节亚基、蛋白质二硫键异构酶前体。对差异蛋白进行功能分析,将上述蛋白分为5类,其耐旱机制主要涉及光合作用、能量代谢和物质代谢的维持与调节,逆境胁迫的快速响应以及自由基清除和植物防御功能增强。4.干旱诱导差异表达蛋白基因中有11个基因表达与蛋白变化相一致,其中10个为基因与蛋白同时上调表达,1个基因与蛋白同时下调表达;有5个基因的表达不一致,卤酸脱卤酶、热休克蛋白70、叶绿体锰稳定蛋白、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为下调表达,蛋白则上调表达;而线粒体异柠檬酸摩脱氢酶基因表达为上调,蛋白表达为下调。同一基因在不同品种中表达方式有多种情况:在2个品种中都显著上调表达;在抗旱品种显著上调而在不抗品种中上调不显著;还有的在抗旱品种中上调而在不抗旱品种中显著下调表达。干旱诱导差异蛋白基因在抗旱性强的品种中显著上调表达的数量多于不抗旱品种。