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应用纤毛虫细胞衰老模型进行3种农副产品抗衰老效应及机制的研究

关萍  
【摘要】:农副产品的药用研究近年来发展较快,研究领域主要涉及天然活性物质的提取与鉴定,有效成分的作用效应及机理等。作用效应研究中预防抵抗衰老是一个主要的且较为重要的研究方向。当今国际人口老龄化日趋严重,有关机体退行性病变、衰老机制与抗衰老药物的开发与使用等已渐列入科学研究的前沿。植物天然活性物质及有效成分的提取和分离是研究其食药用效应及作用机理等基础理论研究的首要关键环节,国内外研究人员对其提取方法和提取工艺的优化已久有研究,但由于植物种类繁多、有效成分及含量相异、提取方法不断创新和提取因素复杂等诸多原因,已有研究需要补充和完善,从而摸索针对特定植物特定活性物质定制的最佳提取方案。本研究对3种农副产品(玉米须、油菜花粉和灵芝孢子粉)的5类活性物质的提取工艺进行了改进和完善,有效的提高了提取的效率及品质,并应用3种副产品原粉和提取活性物质进行了抗动物细胞衰老效应及机理的研究。在进行衰老问题的研究时,选择和构建适用性强的动物(细胞)模型是使试验得以顺利进行的必要条件。本研究鉴于纤毛虫作为科学研究模式生物的诸多优势,在文献提示和前期试验的基础之上,尝试建立新型纤毛虫细胞衰老模型,一方面解决了本课题进行农副产品抗衰老研究时,动物(细胞)模型需求量极大的问题;另一方面为其他研究者进行衰老问题的探讨提供了良好的研究模型,为抗衰老研究提供了新的途径。主要研究内容及结果如下:(1)对玉米须多糖的水提醇沉法、玉米须黄酮的醇提法、油菜花粉多酚的醇提法和灵芝孢子油的超临界C02萃取法等传统提取方法进行改进和优化,获得了最优提取工艺:①玉米须多糖水提醇沉法最优方案为:提取时间为2.0h,提温度为100℃,料液比为1:35,乙醇体积分数为70%。多糖提取率为4.95%;②玉米须黄酮醇提法最优方案为:提取时间为1.5h,提温度为80℃,料液比为1:35,乙醇体积分数为70%。黄酮提取率为0.45%;③油菜花粉多酚醇提法最优方案为:提取时间为1.5h,提温度为70℃,料液比为1:35,乙醇体积分数为80%。总多酚总提取率为0.45%。④灵芝孢子油超临界C02萃取中萃取最优方案为:萃取压力为25 MPa,萃取温度为40℃,C02流量为15L/hl,萃取时间为80min。灵芝孢子油提取率为15.36%。(2)对玉米须多糖、玉米须黄酮和油菜花粉多酚的半仿生提取法(pH法)设置了符合动物体消化系统环境的较合理的pH值梯度,通过正交试验获得了最优提取工艺,有效提高了提取效率:①玉米须多糖半仿生法最优方案为:提取时间为2.0h,料液比为1:25,仿胃液pH值为2.5,仿小肠消化液pH值为8.0。多糖提取率为5.69%;②玉米须黄酮半仿生法最优方案为:提取时间为2.0h,料液比为1:35,仿胃液pH值为2.5,仿小肠液pH值为8.0。黄酮提取率为0.50%;③油菜花粉多酚半仿生法最优方案为:提取时间为1.5 h,液料比为1:15,仿胃液pH值为2.5,仿小肠消化液pH值为9.0。总多酚提取率为0.52%。(3)对油菜花粉蛋白和灵芝孢子油的半仿生法(酶法)进行改进和优化。依据所使用材料的特殊性(均破壁处理)尝试使用动物消化酶类进行预处理,根据提取物质的种类确定添加酶的种类,设置适合酶类发挥作用的体内环境(pH值和温度等),获得了最优提取工艺,有效提高了提取效率及品质:①油菜花粉4种蛋白半仿生法最优方案为:处理时间为3h,料液比为1:15;②灵芝孢子油半仿生法最优方案:处理时间为1.0h,料液比为1:20,仿胃液处理液pH值为2.5,仿小肠消化处理液pH值为9.0。灵芝孢子油提取率为17.02%(4)对纤毛虫有性生殖控制进行了研究:①对显微手术法进行优化,细胞分裂的2时期均获得较高无小核率:早-中期为40%,中-后期为5%;②筛选出2种对细胞损伤较小的常规药物,研究其对纤毛虫细胞小核分裂的抑制作用,得到了较高的无小核获得率:诺氟沙星对尾草履虫小核去除率为23.33%;次氯酸对尾草履虫小核去除率为26.67%;次氯酸对似织毛虫小核去除率为10%;③应用改良石炭酸品红核染色法研究了纤毛虫自系接合生殖的促成条件及大核活动时期,1.0μg/mL木瓜蛋白酶对尾草履虫的自系接合有较好的促成作用,促成率为5.8%;尾草履虫自系结合大核活动的时间为2-36h。(5)对3种纤毛虫(尾草履虫、第四双小核草履虫和嗜热四膜虫)的无小核无性系进行了衰老规律研究及衰老模型的构建:①阐明3种纤毛虫自然生长过程及衰老规律,明确了“消除氧自由基能力-年龄-代龄”之间的关系;②选取用于高等动物(细胞)衰老模型构建的2种药物(D-半乳糖和过氧化氢)对3种纤毛虫细胞通过不同的给药方式进行处理,研究对细胞的促衰老作用,证实了2种药物对纤毛虫细胞衰老模型构建的适用性;③选取5类13项高等动物(细胞)及纤毛虫常用指标,对快速构建的纤毛虫细胞衰老模型进行了评价,阐明了这些指标与细胞衰老之间的密切关系。(6)应用纤毛虫细胞衰老模型,对3种农副产品超细原粉和提取的5类活性物质进行了抗衰老效应的研究,并对作用途径和机制进行了初步分析。研究结果显示3种农副产品和5类活性物质均表现出不同程度的抗细胞衰老效应:①玉米须多糖作用于衰老细胞后:p-半乳糖苷酶染色积分光密度最高下降率为20.16%;Caspase-9酶活力最高下降率为20.12%;CDC-2基因mRNA表达量最大值为1.28。黄酮的效应相似于多糖,但作用效应普遍低于多糖;②油菜花粉4种酚酸和4种蛋白分别作用于嗜热四膜虫衰老细胞后,对细胞增值率、生长周期及RCC-1基因mRNA表达量3项指标均产生的作用效果较显著,最大作用效果均显著高于对照组;③灵芝孢子油对自然衰老尾草履虫细胞的最大增殖率为36.67%。对D-Gal促高衰模型的生命周期延长最佳效应为增加7.38天,增加14.86代。消除·OH能力最大增加率为30.77%;丙二醛含量最大降低率为22.22%。细胞内脂褐素含量最大降低率为20.69%。灵芝孢子油对衰老尾草履虫细胞5项指标均产生显著效应;④灵芝孢子粉对延长高衰将死尾草履虫的生存时间和增殖能力效果显著:生存时间延长时间为77.8小时,增加了4.4代。较大程度加强了尾草履虫高衰细胞的生理活性:运动能力最大增加率为65.02%;摄食能力最大增加率为61.90%;排泄和水分调节能力最大增加率为83.87%;⑤3种农副产品超细粉对第四双小核草履虫高衰细胞的抗衰老效果比较:灵芝孢子粉显著高于油菜花粉和玉米须,油菜花粉和玉米须之间差异不显著。


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