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蓝莓酒酿酒酵母及其基因工程改良菌发酵动力学研究

张良  
【摘要】:蓝莓是一种营养丰富、富含花青素和各种微量元素的浆果,其食用价值与药用价值都非常高。目前已经被大量种植,但是经采摘后的蓝莓难以长久保存,除部分鲜食外,大部分需要通过冷冻得以保存,然后再进一步加工。蓝莓发酵酿酒是一种重要的深加工方法。由于其口感特殊、功能强大、营养丰富,蓝莓酒也越来越受到大众的青睐。为了更好的开发蓝莓资源,本研究以辽宁的蓝丰、伯克利、北陆、圣云、北青五个品种的蓝莓为材料,系统的研究蓝莓酒自然发酵特性、蓝莓酒发酵动力学、蓝莓酒发酵工艺优化、发酵过程中有机酸的变化及其对发酵的影响以及利用基因工程方法改良蓝莓酒酵母,以解决果汁中柠檬酸含量高抑制产酒的问题,研究结果如下:1.对五种蓝莓进行自然发酵,结果表明,“蓝丰”品种在试验中CO2减重最大达到0.74g。通过对生长曲线、降糖特性、产酒能力测定,以及比较发酵过程中的电导率变化、发酵液中溶氧变化,发现五个供试蓝莓品种中,“蓝丰”酵母生长最快,且降糖、产酒迅速。进一步对各个品种的发酵动力学研究显示,发酵过程的动态变化可以很好的被预测。五种供试蓝莓酒在发酵过程种菌种生长速率相差不大(除北青酵母菌生长比较慢外);酒精生成速率从快到慢依次是蓝丰、伯克利、北陆、圣云、北青;底物消耗速率由快到慢依次是蓝丰、伯克利、圣云、北青、北陆。由此确定蓝莓酒自然发酵酒的最佳酵母,并拟合蓝莓果酒发酵动力学曲线,为蓝莓酒自然发酵生产提供理论依据。2.通过对酒精发酵过程的动力学分析和研究,建立了发酵过程中菌体生长、酒精生成以及糖消耗的动力学模型。方差分析结果显示,三组模型的决定系数分别为R12=0.991,R22=0.985,R32=0.979,因此可以很好的预测发酵过程的动态变化。进一步对发酵动力学方程求一阶导数得到蓝莓酒发酵过程中,菌种增长速率、酒精生成速率、底物消耗速率,因而更加清楚地认识蓝莓酒发酵过程。3.通过中心组合响应面设计试验确定了蓝莓酒发酵的最佳工艺参数是:加酶量0.13%o,温度22.0℃,接种量1.63%o,在此条件下酒精量为11.8%vol。对影响酒精量的3个因素(加酶量、发酵温度、接种量)的最佳工艺条件进行研究,结果显示3个因素对酒精量的影响是显著的,影响的主次顺序是:温度接种量加酶量。验证试验所得样品的酒精量为11.823%vol,与预测值相差无几,从而验证了模型的可靠性。4.发酵有机酸变化及其对发酵的影响总酸含量随着蔗糖和果糖添加量的增加不断增加,随着葡萄糖添加量的增加不断降低。pH值随蔗糖、果糖和葡萄糖添加量的变化趋势与总酸的变化趋势相反。随着蔗糖含量逐渐增加,草酸和乙酸含量先增加后减少,柠檬酸含量逐渐降低;随着果糖含量逐渐增加,草酸含量先增加之后趋于平缓;随着葡萄糖含量逐渐增加,草酸含量先降低后增加,柠檬酸逐渐降低,说明葡萄糖的加入有助于蓝莓酒中柠檬酸的转化。随着有机酸浓度的增加,PDC酶活不断降低,柠檬酸含量在14.5mg/mL时PDC酶活接近0,而草酸和乙酸对PDC的影响相对较小。随着有机酸含量的增加酶活缓慢降低。随着有机酸浓度的增加,AHD酶活不断降低,柠檬酸含量在25mg/mL时AHD酶活接近0,而草酸和乙酸对AHD的影响相对较小。随着有机酸含量的增加酶活缓慢降低。5.利用基因工程方法将烟曲霉中的柠檬酸裂解酶基因导入到酿酒酵母细胞中,经过表达后,分离纯化柠檬酸裂解酶,并测定该酶的生物学性质,进一步通过发酵试验,验证改良后的菌株发酵蓝莓酒的特性,通过比较得知,新构建的菌株,降糖快,产酒速率提高,发酵周期短。


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