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大垫尖翅蝗抗药性检测及其对丁烯氟虫腈代谢抗性机理研究

金永玲  
【摘要】:大垫尖翅蝗Epacromius coerulipes Ivanov是北方草原的优势种蝗虫,分布广泛,为害严重,成虫还有短距离飞翔能力,可以进行迁移危害,对农牧业生产造成了严重的经济损失。目前对蝗虫的治理仍以化学农药为主,致使蝗虫对常用化学杀虫剂产生抗药性,防治效果下降,蝗灾不断爆发。新型杀虫剂丁烯氟虫腈作为蝗虫防治的应急药剂得到了广泛的应用。为了了解田间大垫尖翅蝗对各种常用杀虫剂的抗性发生发展情况,延长药剂的使用寿命,对蝗虫进行抗性检测、研究蝗虫对丁烯氟虫腈抗性发生的机理对于草原蝗虫的抗性治理和可持续治理具有重要的意义。本文以北方优势种蝗虫大垫尖翅蝗为研究对象,在建立杀虫剂敏感基线的基础上通过田间抗药性检测,丁烯氟虫腈抗性筛选及抗性现实遗传力研究,分析了大垫尖翅蝗对10种杀虫剂的抗药性发展动态及对丁烯氟虫腈抗性产生的风险;同时利用敏感品系和丁烯氟虫腈抗性品系蝗虫测定解毒酶活力,分析其抗性产生的生化机制;利用转录组测序技术获得大垫尖翅蝗转录组信息,鉴定分析与杀虫剂抗性相关的基因和功能以及差异表达情况,然后将筛选出的与抗性密切相关的超表达的P450、GSTs和CarE基因利用RT-PCR技术进行定量验证。具体研究结果如下:一、大垫尖翅蝗对10种杀虫剂的敏感基线构建和田间抗药性检测采集于天然草原的大垫尖翅蝗,经过继代培养后利用点滴法进行毒力测定,建立了10种杀虫剂对大垫尖翅蝗的敏感基线。并以此为基准分别在2010年和2013年对大庆周围草原三个不同地点的大垫尖翅蝗抗性情况进行检测,结果表明:大垫尖翅蝗对菊酯类杀虫剂产生了低水平抗性,抗性倍数在5.07~9.41之间;对辛硫磷的敏感性下降,其他药剂均很敏感。同时抗性监测结果也表明,在害虫抗性水平较低的情况下停止用药,害虫会在很短的时间内恢复对药剂的敏感性。在菊酯类农药中混用PBO或在辛硫磷杀虫剂中混用TPP,对杀虫剂均表现出明显的增效作用。可见,该研究为蝗虫抗性治理和综合治理提供药剂的选择和应用的指导,对农牧业生产具有一定的实践意义。二、抗丁烯氟虫腈大垫尖翅蝗的选育及抗性风险评估利用丁烯氟虫腈对大垫尖翅蝗进行连续7代的筛选,抗性增加到11.74倍。从抗性选育的过程看,连续筛选的前4代抗性增长较慢,到F5代抗性增长加快。通过7代的大垫尖翅蝗抗性的现实遗传力的评估,h2=0.3191。同时,推算田间条件下大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性倍数提高10倍需要12~25代,由于大垫尖翅蝗在北方一年仅发生一代,可见抗性风险并不高。三、大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性的生化机制利用活体增效试验和解毒酶活力测定方法,对大垫尖翅蝗丁烯氟虫腈抗性发生的生化机理进行了研究。酶活性测定结果表明:抗性品系中三种解毒酶的活性均显著升高,其中多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性分别是敏感品系的4.04倍、1.94倍和1.34倍。同时,经过丁烯氟虫腈不同剂量诱导后,多功能氧化酶和酯酶在抗感品系中都得到显著诱导,谷胱甘肽S-转移酶仅在抗性品系中诱导显著。增效剂试验结果表明:PBO对抗感试虫的增效作用最显著,TPP次之。而DEM则仅对抗性品系表现出增效作用。综合分析认为多功能氧化酶活性增强在抗性形成中发挥的作用较大。但是酯酶和谷胱甘肽S-转移酶也都可能是大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈抗性产生的因素之一四、大垫尖翅蝗转录组测序利用Illumina/Solexa HiseqTM 2500二代测序平台,在无参考基因组下对大垫尖翅蝗转录组测序,共获得13.4 G原始数据并组装成63,033条unigenes,平均长度为772 bp和N50为1589bp。共计有25,132条unigenes被成功注释,占大垫尖翅蝗总unigenes数目的39.87%。KEGG分析,7,218 unigenes形成218代谢或信息通路。其中,266 unigenes参与外源性物质或药物的代谢途径。此外,5,696简单序列重复被检测到。该转录组测序分析为进一步研究大垫尖翅蝗杀虫剂的抗药性机制及基因功能分析奠定了分子基础。五、差异表达基因分析利用大垫尖翅蝗转录组测序数据库,比较了PS和PR两个品系的基因表达,并对差异表达基因进行了GO、Pathways显著富集分析。结果表明:2,568条差异表达基因中有1,646条上调,922条下调。G0显著富集分析表明细胞组分中显著富集的有61条DEGs;生物学过程显著富集的有150条DEGs,分子功能显著富集的127条DEGs中,氧化还原酶活性基因序列有37条,其表达量上调23条,下调14条,有5条序列在Nr数据库中注释为P450基因。利用topGO软件对注释到G0数据库的差异表达基因进行分析,分子功能中显著富集的节点600052689具有羧酸水解酶活性,4条注释为羧酸酯酶,且高表达说明该节点参与杀虫剂的代谢过程。COG分类中,Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism差异表达基因数量达到28条,占总数2.98%,比例提高。KEGG注释中,差异基因分布在130个代谢通路中。其中核糖体Ribosome,淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism,抗坏血酸和代谢Ascorbate and aldarate metalolism,借助细胞色素p450药物代谢Drug metabolism-cylochrome p450,外源物质p450代谢Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450,糖酵解/糖的异生Glycolysis/Gluconeogenesis,谷胱甘肽代谢Glutathione metabolism 7个通路富集程度最高。其中Drug metabolism-cylochromeP450、Metabolism of xenobiotics by cytochrome p450和Glutathione metabolism三条代谢通路是杀虫剂代谢最重要的路径,对大垫尖翅蝗的研究发现有23条差异基因(上调11条,下调12条)注释到这三条代谢通路中。从代谢通路图中发现与上调基因有关的蛋白有很多,其中谷胱甘肽S-转移酶[EC:2.5.1.18]在三条代谢通路图中都有上调的表现,且出现频率最高。还有大量的脱氢酶和转移酶在代谢通路中上调。这些酶都有可能参与蝗虫对杀虫剂的代谢降解作用。可见这些基因和蛋白是后续基因功能研究和代谢通路研究的基础。六、杀虫剂抗性相关基因的注释和分类在大垫尖翅蝗转录组信息中筛选与杀虫剂抗性相关的基因序列,结果显示316条编码p450、CarE和GSTs三大解毒酶的基因被注释,76条编码杀虫剂目标蛋白的基因被注释。G0数据库注释显示,213 unigenes被确认为可能参与外源性物质的解毒,34条unigenes被确定为编码杀虫剂目标蛋白质。对这些解毒酶基因及靶蛋白基因的SNP位点进行统计分析,有AT、AC、AG、GT、CG、CT类型,共计416个SNP位点被发现。可以通过这些SNP位点来挖掘和发现抗性相关的基因突变。针对大垫尖翅蝗转录组测序结果,与已知基因组信息的物种进行比对,采用NJ法构建p450、CarE、GSTs的系统进化树,结果显示58条p450基因分属于14个CYP家族,52条CarE分属于5个家族,24条GSTs被划分为GSTs的六个家族和Micromal。这些解毒酶的大部分基因家族在C0和COG数据库中的注释均显示可代谢杀虫剂。同时这些解毒酶基因中有48条差异表达(23条上调,25条下调)。这些差异基因将是进一步研究抗性发生机理的主要候选基因。七、超表达解毒酶基因的定量检测选择大垫尖翅蝗转录组中与杀虫剂代谢相关的显著上调表达的解毒酶基因序列,利用RT-PCR技术,以GAPDH为内参基因,通过比较CT值法检测其在PS和PR两品系中的相对表达量。结果显示,在PR品系中5条p450、3条CarE、3条GSTs序列的表达量均高于PS品系,且大部分达到极显著水平。以上结果首先证明差异表达基因的RT-PCR检测与转录组测序结果较一致,即表明转录组测序的准确度和可信度较高,可以以此为基础进行分子生物学的相关研究。其次,更进一步确定了这些解毒酶基因在大垫尖翅蝗抗性品系中超表达。结合前面的生化机理分析,在分子水平上也同样证明大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈的抗药性,与p450、CarE、GSTs三种解毒酶过量表达关系密切。


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