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亚洲玉米螟性信息素结合蛋白的功能研究

孙雅琪  
【摘要】:亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是我国玉米的主要害虫,严重影响玉米的产量和质量。亚洲玉米螟为钻蛀性害虫,给防治工作带来很大困难。昆虫利用嗅觉机制调节行为活动,因而,研究寄主识别机理是调控亚洲玉米螟的重要途径。目前,信息素防治以其绿色安全,高灵敏度等特点,逐渐成为研究热点,但对亚洲玉米螟嗅觉机制的研究尚不完全。为了更深入地了解亚洲玉米螟的嗅觉机制,主要是性信息素结合蛋白pheromone binding proteins (PBPs)在交配、寻找寄主及种间识别过程中所发挥的重要作用,并利用性信息素和植物挥发物对亚洲玉米螟进行监测和防治,本研究以亚洲玉米螟PBP1-PBP5为研究对象,从蛋白质功能及其应用角度开展研究,在PBPs结合能力、功能位点、免疫定位及电生理几个方面对其做了深入系统的研究。为亚洲玉米螟的预测预报、防治等提供理论基础和新的思路。本研究主要取得如下结果:1.利用RT-PCR技术克隆得到亚洲玉米螟5个PBPs基因序列,经表达纯化得到重组蛋白OfurPBP1-5,利用荧光竞争结合试验检测亚洲玉米螟PBPs与性信息素及其拮抗剂的结合能力,结果显示,OfurPBP3与亚洲玉米螟性信息素(Z/E)12-14:OAc结合能力最强,PBP4-5与欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis (Hubner)性信息素(Z/E)11-14:OAc结合能力最强,OfurPBP1-5与性信息素相似物E11-14:OH及拮抗剂Z9-14:OAc都不结合,推测PBP3可能参与亚洲玉米螟性信息素的识别,而PBP4-5参与欧洲玉米螟性信息素的识别。2.利用SWISS-MODEL成功预测了OfurPBP3的三维结构模型,利用CDOCKER软件将亚洲玉米螟性信息素(Z/E)12-14:OAc与OfurPBP3进行对接,预测出Phe12,Ile113, Ile52和Leu94为关键氨基酸位点,并利用定点突变技术结合荧光竞争结合试验对互作关键位点进行验证。3.利用免疫荧光定位技术,观察了重组蛋白OfurPBP1-5在雄蛾各类型触感器中的分布。免疫定位结果显示OfurPBP1和OfurPBP2被标记于毛形感器中,OfurPBP3和OfurPBP5被标记于锥形感器中,OfurPBP4被标记于栓锥感器中,且OfurPBP1-5均在触感器淋巴液中被标记,树突无标记。4.采用触角电位反应技术测试了亚洲玉米螟雌、雄蛾触角对玉米挥发物及性信息素化合物在不同浓度梯度下的反应趋势,确定1 μg/μL为最佳反应浓度,并在该浓度下比较了19种玉米挥发物的EAG反应,同时观察了触角对不同配比Z12-14:OAc/E12-14:OAc在不同浓度梯度下的反应趋势。结果显示:亚洲玉米螟雄蛾触角对1-辛烯-3-醇反应强烈,而雌蛾触角对壬醛反应最强烈。雄蛾触角对亚洲玉米螟性信息素E12-14:OAc和Z12-14:OAc反应极强,而雌蛾触角对拮抗剂Z9-14:OAc反应比对性信息素反应强。在不同浓度配比试验中,浓度在0.01μg/μL~1μg/μL时,雄蛾和雌蛾触角对性信息素和玉米挥发物的EAG反应值均随浓度的升高而变大;随着性信息素配比中E12-14:OAc比例的增加,EAG反应值下降。


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