嘧肽霉素对烟草花叶病毒蛋白质表达作用机制研究

【摘要】：嘧肽霉素(Cytosinpeptidemycin,CytPM)是新型的抗病毒药剂,由沈阳农业大学植物病毒研究室从链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus var.liaoningensis)中提取的,该药剂对抗病毒的防效较好,然而这种药剂的具体分子水平上的抗病毒机制还不够明确。本文首先用重组质粒pET28a-HEL表达蛋白质后并以纯化的蛋白质为抗原,制备了特异的多克隆抗体,并建立了多克隆抗体的检测体系,最后通过Northern blot和Western blot实验分析了嘧肽霉素对TMV的p126蛋白质具有抑制作用。重要研究成果如下:1.成功构建了原核表达纯化载体pET28a-HEL、pET32a-HEL、pET28a-MET、pET32a-MET,将构建好的质粒转化至感受态细胞BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白质,获得大小分别约为25kDa、39kDa、30kDa、45kDa的重组蛋白质,与预期的蛋白质大小一致;并发现重组蛋白质pET32a-MET和pET32a-HEL经超声破碎离心后,沉淀处呈现出了大量蛋白质条带,上清中的蛋白质条带量较浅,不适于作为后续的抗原;而pET28a-HEL的蛋白质条带较干净单一,故而选择pET28a-HEL进行后续的纯化实验,该原核表达载体的成功构建为后续多克隆抗体的制备奠定了基础。2.建立了 TMV-LN抗体检测体系,制备了 p126抗体。采用Dot-ELISA实验检测了抗体可用性,发现用CDP-Star显色的NC膜经过曝光可看到感染TMV的烟草叶片具有特异性斑点,而感染PMMoV的烟草叶片与健康的烟草叶片未见斑点;经NBT、BCIP显色反应的NC膜上接种了 TMV的烟草叶片发生变色反应,感染PMMoV的烟草叶片与健康的烟草叶片没有发生特异性反应,说明该抗体能够与抗原结合,表明该抗体可用。采用Western blot实验检测了该抗体的特异性,发现在接种TMV烟草叶片以及BY-2原生质体样品中,在130kDa附近出现明亮的条带,判断此条带为TMV的复制蛋白质p126,此外在180kDa处出现疑似p183的条带;健康的、未感染TMV的烟草叶片样品作为对照,没有条带出现。经过免疫反应的PVDF膜背景干净清晰且无杂带,表明抗体特异性较强,用于TMV p126的检测试验p126多克隆抗体制备成功,为详细研究TMV-LN的翻译机制供给重要的研究手段。同时,也可用于详细研究与p126互作、在病毒侵染过程中发挥重要作用的寄主蛋白质。3.揭示了嘧肽霉素对TMV p126的表达以及核酸复制具有抑制作用。Northern blot检测TMV RNA积累量,发现BY-2烟草原生质体在用稀释了 3200倍的嘧肽霉素处理后,原生质体内几乎没有TMV RNA正义链和负义链的积累,表明嘧肽霉素对TMV的RNA的正义链与负义链的具有很强的抑制作用;Western blot实验检测BY-2细胞中的TMV病毒的p126蛋白质,实验结果表明,用稀释3200倍嘧肽霉素处理BY-2细胞后,与TMV病毒共培养后没有检测到TMV病毒的p126复制蛋白质及外壳蛋白质CP,而对水处理BY-2细胞与TMV病毒共培养后进行Western blot检测,发现在与TMV共培养3h后就已经能检测到微弱的p126复制蛋白质条带,随着培养时间延长,检测到的p126复制蛋白质条带的浓度越高,综上说明嘧肽霉素确实能够抑制TMV病毒的p126蛋白质合成。此研究为深入了解嘧肽霉素对TMV病毒的分子抗病机理提供了重要参考价值。